猪弓形虫病鉴别诊断分析

王振玲，王利丽，路 超，杨利峰，郭艳杰

（1.北京农业职业学院，北京102442；2.天津市畜牧兽医研究所，天津300112；3.中国农业大学，北京100093；4.大连医科大学，大连116044）

弓形虫是细胞内寄生虫，寄生于细胞内，随血液流动，到达全身各部位，破坏大脑、心脏，致使家畜免疫力下降，引发各种疾病。孕畜感染后，会出现流产、弱胎、畸胎、死胎和幼畜生长受阻，也可通过胎盘传染给子代。该病广泛存在于世界各地，是一种世界性分布、备受重视的寄生虫病，其终末宿主为猫科动物，而中间宿主范围十分广泛，人及大多数动物感染率都较高。近几年，由于很多养殖户对猪的弓形虫病认识不够，往往在生产实践中易被忽视和漏诊，弓形虫病在猪场发病率开始呈上升趋势，严重影响着养猪业的发展。2017年4月中旬，北京某猪场饲养的20多头肥猪，体表无异常病变，陆续出现精神沉郁、食欲不振、行走摇晃、喜卧、呼吸急促等症状，解剖发现肝脏、肾脏上有灰白色坏死点[1,2]，回盲口有扣状溃疡等病变[3,4]，并且采用安乃近、头孢噻呋、氟苯尼考和替米考星等多种药物进行治疗，不见明显效果。本实验随机选取了3头发病猪，采集其前腔静脉血和病变组织进行实验室胶体金抗原检测、PCR检测、免疫荧光和蛋白免疫印迹检测。结果显示，病猪感染了弓形虫，而未有猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的感染。

1 材料和方法

1.1 病毒 猪瘟兔化弱毒疫苗购自广东永顺生物技术有限公司，伪狂犬病毒MinA株购自中国兽医药品监察所。

1.2 试剂 HE染色法相关染色液由实验室自配；TaqDNA Polymerase、TIANamp Genomic DNA Kit、血液、细胞、组织基因组DNA抽提试剂盒均购自天根生物技术有限公司；TRizol RNA提取试剂、M-MLV反转录酶、5×RT buffer、RNase inhibitor、dNTP、Random primer（50 pmol/μL）、2×GC buffer I、dNTP、DNA Marker、核酸染料goldview等均购自宝生物工程（大连）有限公司。弓形虫抗血清由中国农业大学原虫病实验室馈赠，山羊-猪Cy3抗体及山羊抗猪HRP抗体购自美国Proteintech公司。

1.3 胶体金快速诊断试纸条 猪弓形虫抗原和猪瘟抗原胶体金检测试纸条，购自上海快灵生物技术有限公司。

1.4 血样采集 随机挑选45公斤左右的发病猪3头，前腔静脉采血，分离血清，用于猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒和弓形虫检测。采血后对其进行剖检。

1.5 病料采集 采集剖检猪的淋巴结、会厌软骨、扁桃体、心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、膀胱黏膜、肠管。所有脏器分成2份，1份用10%福尔马林固定病理学组织检查；另1份按照常规方法收集，用于病原体检测。

1.6 组织病理切片制备和观察 按照常规方法制备石蜡切片，切片厚5 μm，HE染色，OLYMPUS U-SRG数码显微镜观察并采图。

1.7 猪弓形虫病检测

1.7.1 猪弓形虫抗原免疫胶体金检测试纸条进行初步检测 取1.5 mL离心管，采血0. 5～1 mL，3000×g离心10 min，分离血清。按照猪弓形虫抗原一步法胶体金快速诊断试纸条说明书进行操作，检测弓形虫抗原。

1.7.2 Western blot鉴定弓形虫抗体 取5 μg弓形虫虫体蛋白（中国农业大学提供）进行12%的SDSPAGE。将弓形虫虫体蛋白转印PVDF膜后，剪下3个泳道的PVDF膜分别孵育病猪血清、正常猪血清、人工感染弓形虫的阳性猪血清（中国农业大学原虫实验室提供），洗膜3次后，孵育山羊抗猪HRP二抗，PBS洗膜3次后，用化学发光试剂盒检测结果。

1.7.3 免疫荧光检测弓形虫 将弓形虫铺于6孔板，应用0.3% Triton X-100作用10 min，3% 胎牛血清封闭，一抗分别孵育病猪血清、正常猪血清、人工感染弓形虫的阳性猪血清；二抗为山羊-猪Cy3，荧光显微镜下观测结果。

1.8 猪瘟病毒抗原检测

1.8.1 胶体金检测卡 应用上面1.4分离的血清，按照猪瘟病毒抗原一步法胶体金快速诊断试纸条说明书进行操作，检测猪瘟抗原。

1.8.2 RT-PCR检测 按照TRizol提取RNA法提取3头发病猪的淋巴结、肺脏和脾脏中的RNA，参照文献[5]所述方法进行RT-PCR检测。

1.9 猪伪狂犬病毒PCR检测

1.9.1 引物及PCR反应参数 选择猪伪狂犬病病毒gE基因中保守的核苷酸序列设计1对引物。U3：5'-AT GGGCATCGCCGACTACCT-3'，L3：5'-CCACCG CCACAAAGAACAG-3'。PCR反应体系（20 μL）：2×GC buffer I 10 μL，dNTP 2 μL，U3、L3引物各1 μL，模板5.5 μL，Taq酶0.5 μL，补充ddH2O至20 μL。PCR反应参数：94℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；终末延伸72℃ 10 min。按照TIANamp Genomic DNA Kit法提取3头发病猪的脑、肺脏和肝脏中的DNA。

1.9.2 样品检测 按照上述PCR反应程序进行扩增，产物用琼脂糖电泳进行检测。

2 结果

2.1 剖检病理变化 3头发病猪的病理变化基本相同，均见有回盲口扣状溃疡（图1A、B、C）；腹股沟浅淋巴结正常，腹股沟深淋巴结切面周边出血；会厌软骨、扁桃体、膀胱黏膜均无异常病理变化；脾脏一端淤血（图1D）；肝脏表面有少量散在白色斑点（图1E）；肾脏表面有大量散在白点，切开肾脏，皮质、髓质未见出血点（图1F）。

图1 剖检病理变化Fig.1 Pathological changes

图2 发病猪的组织病理学检查Fig.2 Pathological examination of sick pig tissue

2.2 组织病理变化 低倍镜下，回盲口绒毛脱落，不完整（图2A），高倍镜下，杯状细胞增多，粘液分泌亢进，固有层有大量炎性细胞浸润，局部肠腺上皮细胞坏死、脱落（图2B）；低倍镜下，可见肝小叶间质显著增宽、增厚（图2C），高倍镜下，可见汇管区胆管增生，大小数量不一，间质有大量炎性细胞浸润（图2D、E）；肺脏病变处显示肺泡结构几乎消失，肺泡腔内充满大量巨噬细胞、嗜中性粒细胞及吞噬崩解后的细胞碎片等（图2F）；部分肾小管上皮细胞增生、肿胀、脱落，细胞界限不清晰，胞浆淡染，胞核挤向一侧，部分细胞破裂脱落至管腔中，局部区域有大量蓝染淋巴样细胞聚集，细胞呈圆形、椭圆形，核质比高，胞浆较少（图2G、H、I）；脾脏红白髓界限不清，部分红细胞破裂、溶解（图2J）。

2.3 弓形虫检测结果

2.3.1 弓形虫抗原免疫胶体金检测 对采集的3份血清应用弓形虫抗原免疫胶体金检测试纸条检测，结果均为阳性，见图3A。

2.3.2 Western blot检测 Western blot检测病猪弓形虫血清抗体的结果显示，人工感染弓形虫的阳性对照猪血清及病猪血清内弓形虫抗体检测的信号较强，而正常猪血清内检测不到弓形虫抗体，见图3B。以上结果说明，病猪存在明显的弓形虫感染。

2.3.3 免疫荧光检测 应用免疫荧光检测结果显示，人工感染弓形虫的阳性对照猪血清及病猪血清内能够检测到与弓形虫结合的抗体，而正常猪血清内则检测不到弓形虫抗体，见图4。以上结果说明，发病猪体内存在弓形虫感染。

图3 弓形虫检测结果Fig.3 Detection results of Toxoplasma gondii

图4 免疫荧光检测弓形虫感染Fig.4 Immuno fl uorescence assay of Toxoplasma gondii infection

2.4 猪瘟病毒抗原检测结果 应用猪瘟病毒抗原胶体金检测试剂卡对采集的3份血清进行检测，结果均为阴性（图5A）。对采集的3份发病猪样品进行猪瘟病毒RT-PCR检测，琼脂糖凝胶电泳未见预期目的条带，说明样品中未检出猪瘟病毒，见图5B。

2.5 猪伪狂犬病毒gE基因PCR检测 对采集的发病猪样品进行猪伪狂犬病毒PCR检测，3份样品均为阴性，见图6。

图5 猪瘟病毒抗原检测结果Fig.5 Swine fever virus antigen detection results

图6 猪伪狂犬病毒gE基因PCR检测结果Fig. 6 PCR detection of Pseudorabies virus gE gene

3 讨论

在临床诊断过程中，结合病猪临床症状和死后剖检变化，很难鉴别猪瘟、猪伪狂犬病和猪弓形虫病。董筱萍[6]报道，脑炎、肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、淋巴结的出血和灰白色坏死点是猪伪狂犬病主要特征性剖检病变，这些脏器的病理组织变化呈局灶性核碎裂性坏死和出血。本病例肝脏表面有白点，病理组织切片观察肝小叶间质显著增宽、增厚、有大量炎性细胞浸润，汇管区胆管增生，大小数量不一，并未呈现典型的局灶性核碎裂性坏死和出血特征，与猪伪狂犬病肝脏的灶性坏死有些不同。猪肾脏表面有大量针尖大白点，病理组织学变化显示部分肾小管上皮细胞增生、肿胀、脱落，细胞界限不清晰，胞浆淡染，胞核挤向一侧，部分细胞破裂脱落至肾小管管腔中，肾小管上皮细胞的损伤特征与猪圆环病毒（断奶仔猪多系统综合征）导致的非化脓间质性肾炎略有不同[7]，所以，仅通过肉眼观察，对猪瘟、猪伪狂犬病、猪弓形虫病进行鉴别困难很大，还应结合疾病流行病学特点、病理变化及实验室检测进行综合分析，做出准确结论，确定科学的免疫防控程序，更好地指导生产。

猪弓形虫病诊断方法有脏器直接触片染色检查、间接血球凝集试验、动物接种及染色试验、中和抗体试验、补体结合反应、荧光抗体反应和酶联免疫吸附试验等。在这些方法中，直接触片染色检查很难直接查到弓形虫病原，极易出现漏检。中和抗体试验、补体结合反应、荧光抗体反应和酶联免疫吸附试验有敏感、特异等特点，但由于分子生物学检测需要特殊的仪器设备，技术相对复杂，对实验室条件和操作人员的要求比较高，比较适用于实验室研究，不能向基层广大兽医人员进行推广应用。有资料报道[8]，常规组织染色的病理组织切片的病变特征和弓形虫的结构可确认弓形虫虫体，但实际上经多次进行病理组织切片观察时，很难在脑、肺脏等弓形虫感染的多个脏器里面切到病原，主要原因是在制片过程中很难切到有4～8 μm×2～4 μm大小的速殖子或缓殖子的部位。迄今为止，猪弓形虫抗原检测试纸条是养殖户或技术人员比较容易接受的快速检测方法。本次试验采用弓形虫免疫荧光和蛋白免疫印迹检测结果与胶体金检测方法吻合度较高，更加印证了这个观点。

在养殖过程中，大家都很注意养、繁、防、治这四方面的管理，也特别强调这四个方面的重要性，但有时还会出现防不胜防的这样或那样的疾病发生。在近几年对各大猪场进行技术服务的过程中，经常遇到不同日龄阶段的猪感染弓形虫病 。对于这些病猪，采用临床症状和病理剖检很难作出诊断，尤其在有回盲口扣状溃疡这种病变的前提下，常常容易误诊为慢性猪瘟。本研究通过病理组织学观察、猪瘟病毒抗原的胶体金检测和PCR检测证明，发病猪未有猪瘟病毒感染。由此，说明对疑似病料做进一步诊断研究非常有必要，误诊将会误导猪场免疫防控措施的制定，甚至带来巨大的经济损失。

[1] 潘耀谦, 刘兴友. 猪病诊治彩色图谱[M]. 2版, 北京： 中国农业出版社, 2010： 52-89.

[2] 宣长和, 马春全, 林树民, 等. 猪病混合感染鉴别诊断与防治彩色图谱[M]. 北京： 中国农业出版社, 2009： 42-45.

[3] 徐国栋, 王立宾, 张雪峰, 等. 天津地区的猪瘟流行趋势[J]. 中国动物保健, 2007(1)： 58-60.

[4] Barbara E S. 赵德明, 张仲秋, 沈建忠, 等, 译. 猪病学[M].9版. 北京： 中国农业大学出版社, 2009： 330.

[5] 李艳, 仇华吉, 王秀荣, 等. 鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应（RT-nPCR）检测方法的建立[J].中国农业科学, 2006, 39(9)： 1907-1914.

[6] 董筱萍, 高慎阳, 王辉暖, 等. 辽西地区猪伪狂犬病的病理学特征及病毒组织嗜性[J]. 畜牧与兽医, 2015,47(4)：104-108.

[7] Babara E S, Jeffrey J Z, Sylvie D A,et al. 赵德明, 张仲秋,沈建忠, 译. 猪病学[M]. 9 版. 北京： 中国农业大学出版社, 2009： 316.

[8] Jeffrey J, Locke A K, Alejandro R,et al. 赵德明, 张仲秋,周向梅, 等, 译. 猪病学[M]. 10 版. 北京： 中国农业大学出版, 2014： 944.