表达Strep-tag的重组H5N6亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立

周圆一，王正祥，汪 亮，徐 帅，曾巧英

（1.甘肃农业大学，兰州 730070；2.中国农业科学院兰州兽医研究所 兰州 730046）

禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的一种疾病综合征，AIV不仅可感染家禽还可以感染人和哺乳动物，在公共卫生学上具有重要意义。禽流感病毒属于正黏病毒科（Orthomyxovirus）A型流感病毒属，是一种单股负链RNA病毒。根据血凝素（Hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）的不同，将A型流感病毒分为18种HA亚型以及11种NA亚型[1,2]。

H5N6 AIV于1975年从北美的野鸭群中首次分离出来[3]。在中国，H5N6 AIV于2013年首次出现，近年来在野生水禽和禽类中广泛流行[4-6]。H5N6亚型禽流感病毒不仅可导致家禽严重发病，部分病毒还可感染人并引发严重临床症状和死亡[7]。由此可见，H5N6 AIV对人类乃至整个社会公共卫生造成严重威胁。因此研究H5N6 AIV有重要的意义。

H5N6 AIV基因组由8个基因片段组成，至少编码12种以上的蛋白，其中NS1是一种非常重要的与病毒毒力密切相关的调控蛋白。NS1蛋白在受感染的宿主细胞中合成，与宿主细胞内多种蛋白分子相互作用，产生复杂的生物学效应，从而调控病毒的复制与增殖[8]。

Strep-tag由8个氨基酸组成，该标签通常对蛋白质的结构和活性没有影响，并且strep-tag标签序列被设计成以高亲和力且可逆地结合链霉亲和素，使其能够高效快捷地分离完整的蛋白质复合物，这将为纯化禽流感病毒在感染期间与NS1相互作用的宿主蛋白提供更加高效快捷的途径[9,10]。

本研究成功构建了H5N6 AIV的反向遗传操作系统，通过序列测定、生长曲线、动物试验等证明拯救毒株与野生毒株的生物学特性一致。本研究结果将为H5N6 AIV的分子致病机理及新型疫苗的研制奠定极其关键的基础。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞和实验动物 H5N6 AIV HN109株由中国农业科学院兰州兽医研究所动物病毒分子生态学创新团队分离并保存；293T细胞和MDCK细胞用含5%FBS的DMEM于37℃、5%CO2培养箱中培养；双向表达载体pBD由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所陈化兰研究员馈赠；SPF鸡胚购自山东昊泰试验动物繁育有限公司；6周龄BALB/c雌性小鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所。

1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；DMEM及胎牛血清购自GIBCO公司；HRP标记的羊抗鼠IgG购自Abmart公司；HRP标记的Strep抗体购自IBA公司；ExnaseⅡ酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.3 引物设计与合成 根据本实验室对 H5N6 AIV HN109株的全基因组测序结果，采用Oligo7.0软件设计扩增流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因的引物以及Strep替换引物（表1）。引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.4 病毒RNA的提取及目的片段的扩增 根据RNeasy Mini Kit（天根生化科技(北京)有限公司）说明书，从感染H5N6 AIV HN109株的SPF鸡胚尿囊液中提取总RNA，利用流感病毒通用的12 bp引物反转录得到病毒cDNA，并以cDNA为模板，用高保真酶扩增病毒的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS8个基因片段。

1.5 重组质粒的构建 经过RT-PCR扩增的H5N6 AIV HN109株的8个基因片段进行核酸电泳，切取分子量大小相符的片段进行胶回收。将pBD线性化载体和纯化后的PCR产物通过同源重组法进行连接，连接体系（20 μL）：5×CEⅡbuffer 4 μL、pBD线性化载体2 μL、目的片段2 μL、ExnaseⅡ酶2 μL、灭菌ddH2O补足至20 μL。37℃孵育30 min，放冰上5 min。取上述连接产物10 μL转入感受态细胞Trans5α中，挑取单菌落接入含氨苄的LB液体培养基中震荡培养12 h。小提质粒后，将阳性质粒送去北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定，序列正确的阳性质粒命名为pBD-NS。

将构建成功的重组质粒pBD-NS通过定点突变法对其77～84位的氨基酸进行突变，突变引物见表1。以pBD-NS质粒为模板，以高保真酶进行PCR扩增，PCR反应体系如下（50 μL）：5×PCR buffer 10 μL、dNTP（10 mmol/L）1 μL、引物NSStrep-F和NS-Strep-R（10 μmol/L）各2.5 μL、50 ng模板和1个单位的PCR高保真酶、灭菌ddH2O补足至50 μL。PCR条件：95℃预变性30 s；95℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，22个循环；最后72℃延伸10 min。取35 μL PCR反应产物，加入1个单位的DpnⅠ限制性内切酶和5 μL 10×Cutsmart buffer，37 ℃酶切1 h，取上述酶切产物10 μL转入感受态细胞Trans5α中，挑取单菌落接入含氨苄的LB液体培养基中震荡培养12 h。小提质粒后，将阳性质粒送去北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定。

表1 A/Goose/Hunan/109/2014毒株8个基因片段的扩增引物Table 1 Primers for ampli fi cation of 8 segments of A/Goose/Hunan/109/2014

1.6 病毒拯救及鉴定

1.6.1 病毒拯救与纯化 将293T细胞培养至6孔细胞板中，待细胞密度达到80%～90%时开始转染。将构建好的质粒pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBDHA、pBD-NP、pBD-NA、pBD-M、pBD-NS1-Strep各500 ng加入含有250μL OPTI-MEM中。另将10 μL Lipofectamine 2000转染试剂加入OPTI-MEM中混匀后室温静置5 min。将转染试剂与质粒混匀后室温静置25 min，加入到用OPTI-MEM清洗2次的6孔细胞板中，37℃细胞培养箱培养48 h后收取细胞上清接种到9～11日龄SPF鸡胚中。SPF鸡胚于37℃继续孵化48 h，收集鸡胚尿囊液进行血凝实验，将有血凝活性的尿囊液进行10倍倍比稀释，每个稀释度的病毒液以每枚胚100 μL接种9～11日龄SPF鸡胚，48 h后收取尿囊液。进行血凝实验，选取最大稀释度最高血凝效价尿囊液，按照有限稀释法稀释病毒，接种至SPF鸡胚纯化5代。

1.6.2 拯救病毒的鉴定 从获救病毒尿囊液中提取RNA，通过RT-PCR扩增获救病毒的8个基因片段，对其序列测定并与亲本病毒序列进行比较分析。

1.7 拯救病毒Strep-tag遗传稳定性鉴定 通过SPF鸡胚纯化第5代的HN109病毒尿囊液（HN109-F5）、rHN109-NS1-Strep第1代（rHN109-NS1-Strep-F1）、第3代（rHN109-NS1-Strep-F3）和第5代（rHN109-NS1-Strep-F5）的病毒尿囊液感染MDCK细胞，24 h后收集蛋白样品。将蛋白样品进行SDS-PAGE分析后，转移到NC膜上，转膜结束后用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，将稀释后的一抗与NC膜室温孵育1 h，用TBST缓冲液洗涤3次。将稀释后的二抗与NC膜室温孵育1 h，用TBST洗涤后加入显色液，暗室曝光。

1.8 病毒的生长曲线 分别以0.01 MOI和2 MOI的病毒量将病毒株HN109和rHN09-NS1-Strep接种到培养MDCK细胞的12孔细胞板中，按照时间点收集细胞上清，每个时间点做3次重复。将收集的细胞上清用灭菌的PBS进行10倍的倍比稀释，然后接种至9～11日龄鸡胚，每个稀释度接种3枚鸡胚，每枚100 μL，测定病毒滴度，利用GraphPad Prism 6软件绘制生长曲线。

1.9 小鼠的感染性试验 将病毒稀释至106EID50/50 μL并置于冰盒中，将6周龄BALB/c雌性小鼠用干冰麻醉，吸取50 μL病毒液，通过鼻腔感染干冰麻醉的小鼠。感染第5 d后安乐死3只小鼠，采集脑、鼻夹、肺脏、肾脏、脾脏组织，测定脏器中的病毒含量。其余小鼠感染后每天称体重，直至感染后第14 d对其安乐致死。

2 结果

2.1 H5N6 AIV HN109株各基因片段的扩增 通过RTPCR扩增了H5N6 AIV HN109株的8个基因片段。经核酸电泳鉴定，获得与目的片段大小相等的8个基因片段：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS（图1），扩增的8个基因片段通过同源重组法分别连接到pBD载体，将测序正确的阳性质粒扩大培养，并将NS1质粒的77～84位氨基酸成功替换为Strep-tag。

2.2 病毒拯救与鉴定 将构建好的质粒pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBD-HA、pBD-NP、pBDNA、pBD-M和pBD-NS1-Strep共转染293T细胞，成功拯救重组病毒，命名为rHN109-NS1-Strep，获救病毒血凝效价可达到28。

对获救病毒rHN109-NS1-Strep各基因片段进行RT-PCR扩增并测序，序列比对结果表明PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M基因与野生病毒HN109株序列一致，NS1-Strep基因片段与其设计基因序列一致。表明携带Strep-tag的NS1基因片段已成功构建，并能与其他7个片段重组获得拯救病毒rHN109-NS1-Strep。

图1 H5N6 AIV HN109株8个基因片段RT-PCR扩增Fig.1 Ampli fi cation of eight gene segments from H5N6 AIV HN109 strain by RT-PCR

2.3 拯救病毒Strep-tag的遗传稳定性鉴定 将SPF鸡胚纯化第5代的HN109病毒尿囊液以及rHN109-NS1-Strep第1代、第3代和第5代的病毒尿囊液感染MDCK细胞后，24 h后收集蛋白样品进行Western blot。结果显示，在第1、第3、第5代rHN109-NS1-Strep病毒中Strep标签都稳定存在于NS1蛋白中，见图2。表明Strep标签稳定存在于rHN109-NS1-Strep中。

图2 Western blot鉴定Strep-tag遗传稳定性Fig.2 Identi fi cation of genetic stability of Strep-tag by Western blot

2.4 病毒的生长 曲线分别以0.01 MOI和2 MOI的病毒量将H5N6 AIV HN109株和rHN09-NS1-Strep株接种到培养MDCK细胞的12孔细胞板中，收集不同时间点细胞上清，测定病毒在MDCK细胞中的增殖情况，见图3。结果显示，H5N6 AIV HN109与拯救毒株rHN109-NS1-Strep复制能力基本相似，一步生长曲线中野生病毒HN109株与拯救病毒rHN109-NS1-Strep株在最高滴度都接近106EID50/mL，多步生长曲线中野生毒株HN109与拯救毒株rHN109-NS1-Strep最高滴度都接近106.5EID50/mL，因此，野生病毒HN109株与拯救病毒rHN109-NS1-Strep株在MDCK细胞上的复制能力并无显著性差异。

图3 野生毒株H5N6 AIV HN109与拯救毒株在MDCK细胞的一步生长曲线（A）和多步生长曲线（B）Fig.3 Single cycle growth curves（A） and multi-cycle growth curves （B）of wild-type strain and rescued strainin MDCK cells

2.5 小鼠致病性试验 以106EID50/50μL病毒量鼻腔接种小鼠后，HN109在与rHN109-NS1-Strep株均可引起小鼠体重缓慢上升，但小鼠未出现死亡，也没有表现出明显的临床症状（图4）。病毒感染小鼠5 d后，对小鼠实行安乐死，采集肺脏、鼻甲、脑、脾脏和肾脏，对其病毒含量进行滴定。结果显示，H5N6 AIV HN109株与rHN109-NS1-Strep株均可在肺脏和鼻甲中有效复制，且复制能力相似。但在小鼠的脑、脾脏、肾脏中检测不到病毒的复制（图4）。

图4 小鼠感染H5N6 AIV HN109，rHN109-NS1-Strep毒株后体重变化（A）和各组织脏器病毒滴度（B）Fig.4 The body weight change（A） and virus titer in organs （B）of mice after intranasal inoculation with 106 EID50 dose of HN109 and rHN109-NS1-Strep strains

3 讨论

NS1蛋白是A型流感病毒重要的毒力因子，可以通过多种方式与宿主细胞功能分子相互作用[11,12]。NS1可以抑制细胞凋亡，从而保证病毒能够充分地生长复制[13]；流感病毒感染后，NS1蛋白可以破坏细胞核内宿主mRNA前体3'端的正常加工，使其不能由细胞核输出到细胞质中[4,15]；NS1蛋白还可阻碍干扰素的产生并拮抗其对流感病毒的杀伤作用[16]等。

有研究表明，NS1蛋白的RNA结合结构域和效应结构连接区的氨基酸残基D74-L77和K79-R83是高度可变的[17]。并且关于NS1的X射线结构分析发现，对应于75～79氨基酸残基的区域未明确定义，说明连接区在本质上具有高度灵活性[18]，适于修饰。有研究报道表明，对NS1蛋白77～84位氨基酸引入Strep-tag序列，并不影响病毒的生物学特性[19]。因此我们对NS1蛋白第77～84氨基酸位置特异性的引入Strep-tag序列，并拯救出带有Strep-tag的重组毒株rHN109-NS1-Strep。病毒一步生长曲线和多步生长曲线表明野生病毒H5N6 AIV HN109株与拯救病毒rHN109-NS1-Strep株在MDCK细胞上的复制能力并无显著性差异。在研究病毒对小鼠的致病性实验中，野生病毒H5N6 AIV HN109株与拯救病毒rHN109-NS1-Strep株均可在小鼠呼吸道内复制，但是小鼠并未表现出明显的体重下降，也不对小鼠致死，这是因为没有检测到野生病毒H5N6 AIV HN109株与拯救病毒rHN109-NS1-Strep株在小鼠大脑中复制，而之前研究发现，流感病毒能够进入大脑并在大脑复制，可能是其对小鼠呈现高致病性并致死的原因[20]。这些结果表明Strep标签的插入并不影响病毒的生物学特性。

所有这些结果表明，本研究所建立的H5N6 AIV的反向遗传操作系统为进一步研究病毒复制机制及致病机理提供研究平台，同时为H5N6 AIV新型疫苗的研制开辟了新的方向。

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