猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立及其应用

肖 琦 ，茅爱华 ，汪 伟 ，俞正玉 ，郭佳慧 ,2，袁万哲 ，赵攀登 ，温立斌 ，范宝超 ，李 彬 ，朱雪蛟，胡屹屹，郭容利，曲 梦,5，杨 倩，何孔旺

（1.江苏省农业科学院兽医研究所 农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，南京210014；2. 扬州大学兽医学院，扬州225009；3. 河北农业大学动物医学院，保定071001；4. 河南牧业经济学院动物医学院，郑州450046；5.西藏大学农牧学院，林芝860000；6. 南京农业大学动物医学院，南京210095）

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）是一种环形单链DNA病毒，属于圆环病毒科、圆环病毒属成员[1]，已知的猪圆环病毒（PCV）包括猪圆环病毒1型（Porcine circovirus type 1，PCV1）和猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）。PCV1最初被认为是PK-15细胞培养物的污染物，对猪是非致病性的[2]；与PCV1不同，猪感染PCV2可引起猪圆环病毒病（Porcine circovirus disease，PCVD）或称猪圆环病毒相关疫病（Porcine circovirus associated disease，PCVAD），临床表现主要有断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、繁殖障碍、猪皮炎肾病综合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、先天性震颤（Congenital tremors，CT）、猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC）、肠炎、增生性和坏死性肺炎（Proliferative and necrotizing pneumonia，PNP）等，该病呈全球分布，自20世纪末爆发以来，已给世界养猪业造成巨大的经济损失[3]。2015年6月，美国北卡罗来纳州一个商品猪场的母猪爆发猪皮炎肾病综合征（PDNS）和繁殖障碍，应用宏基因组测序和PCR没有检测到PCV2、PRRSV等已知病毒，但发现了一种基因组长度为2000 bp新的环状DNA病毒，被命名为PCV3[4]。Palinski等[4]应用荧光定量PCR从具有PDNS症状母猪的流产胎儿中检出高拷贝的PCV3。Phan等[5]在心脏和多种全身炎症的猪中也检测到了PCV3。回溯性流行病学调查结果表明，PCV3于2010～2016年间已经在美国猪场普遍存在[4,5]。2017年，Ku等[6]首先报道在中国猪群中也存在PCV3感染，在所检测的辽宁省、江西省等10个省市样品中均可检测到PCV3。本实验旨在建立一种快速、特异、灵敏度高的PCV3 PCR检测方法，并利用该方法对2014～2017年收集的临床病料进行检测，以了解江苏省猪群PCV3的感染情况。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）、猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）为本实验室保存毒株。

1.1.2 临床样品 共1438份样品，采自江苏省2014～2017年267个规模化猪场，其中发病猪组织样品938份、健康猪组织样品500份。-40℃保存备用。

1.1.3 主要试剂 TIANDZ柱式病毒DNAout试剂盒购自北京天恩泽公司；普通2×mix、2000 bp DNA Marker购自广州东盛生物科技有限公司；金牌Mix（green）购自南京擎科生物科技有限公司；琼脂糖购自台湾生工生物工程服务有限公司；pMD19-T载体购自宝生生物工程（大连）有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自康宁生命科学（吴江）有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 运用的Primer Premier 5.0软件，根据GenBank中已登录的PCV3全基因序列设计1对特异性引物PA2F和PA2R，扩增目的片段预期大小为932 bp。PA2F：5'-CAGCTGTGG GCCTCCTAATGAAT-3'；PA2R：5'-CCCCCGT GGCTTGAAATACAG-3'。引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.2 临床样品处理及核酸提取 称量25.0 mg病料组织，放入破碎管中，加入1.0 mL浓度为0.01 mol/L的无菌PBS（pH7.2）及3颗钢珠，在均质破碎仪上破碎2～3次，反复冻融3次，4℃ 8000×g离心2 min，收集上清，用TIANDZ 柱式病毒DNAout试剂盒，按说明书的方法提取样品DNA模板。

1.2.3 PCV3阳性质粒的制备 以1.2.2提取的样品DNA为模板，用引物PA2F和PA2R进行PCR反应，将大小为923 bp的目的片段切胶回收，连接pMD19-T载体进行TA克隆，构建pMD19-PCV3重组质粒，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序鉴定。将鉴定含有PCV3目的片段的质粒作为PCV3阳性质粒。

1.2.4 PCR的建立及条件优化 分别设定退火温度（51.5℃～64.5℃）、延伸时间（60 s～75 s）、引物量（0.5 μL～1 μL)、模板量（1 μL～3 μL）几个变量，对PCR检测方法进行优化，获得最佳反应条件。

1.2.5 PCR产物测序鉴定 选取经1.2.3建立的PCR方法检测为阳性的部分样品，将PCR产物切胶回收，TA克隆后，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序结果用DNAStar软件与GenBank中登录的PCV3基因序列进行比对分析，确定PCR扩增片段的特异性。

1.2.6 PCR特异性试验 用1.2.3建立的PCR方法分别扩增PCV1、PCV2、CSFV、PRRSV、PRV和PPV，并以PCV3阳性质粒和ddH2O依次作为阳性和阴性对照，检测该PCR方法的特异性。

1.2.7 PCR敏感性试验 测PCV3阳性质粒的浓度，并依次做10倍梯度稀释，每个稀释度取1μL作为PCR反应模板，进行PCR扩增，测定最低检出浓度，评估该PCR方法的敏感性。

1.2.8 临床样品PCR检测 利用建立的PCR方法对2014～2017年本研究室收集的临床发病猪样品及健康猪样品共1438份进行回顾性检测，分析不同年份猪场及样品中的PCV3的感染情况。

2 结果

2.1 PCV3阳性质粒的制备 用引物PA2F和PA2R对病料DNA进行扩增，得到与预期相符的932 bp的目的条带（图1）。经切胶回收TA克隆后，将pMD19-PCV3重组质粒送测序，测序结果与NCBI公布的PCV3/CN/Hubei-618毒株的同源性达到99.8%，说明构建的PCV3阳性质粒正确。

图1 PCV3 PCR扩增Fig.1 PCR ampli fi cation of PCV3 genome

2.2 PCR反应的建立及条件优化 经条件优化，确定最佳反应体系为25.0 μL：上游引物1.0μL，下游引物1.0 μL，模板1.0 μL，2×mix 12.5 μL，无菌ddH2O 9.5 μL；最佳反应条件：94℃预变性5 min，95℃变性30 s、53.6℃退火30 s、72℃延伸65 s，扩增35个循环，72℃延伸7 min。

2.3 PCR特异性试验 利用建立的最优PCR反应条件，对PCV1、PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、PPV进行扩增。结果表明，建立的PCR方法只能扩增出PCV3样品中的特异性目的片段，而对PCV1、PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、PPV均扩增不出目的片段。虽然PRV出现非特异性目的条带，但大小低于500 bp，而且比较弱，不影响PCV3的结果判定（图2）。表明该PCR方法特异性较好。

2.4 PCR敏感性试验 用建立的最优化PCR反应条件，对不同稀释度的PCV3阳性质粒进行PCR扩增。结果表明，用普通2×mix可检测到的最低质粒浓度为10 copy/μL；用金牌Mix（green），偶可检测到1 copy/μL（图3）。表明该方法具有较好的敏感性。

图2 PCR特异性检测结果Fig.2 Speci fi city test of PCR

2.5 临床样品PCR检测及序列分析 在938份临床发病猪样品中，检出PCV3阳性样品65份，阳性检出率为6.93%；500份健康猪样品仅检出3份PCV3阳性，阳性检出率为0.6%，临床发病猪样品中PCV3的检出率明显高于健康猪。从年份上看，2014年的病料中PCV3的阳性检出率为1.92%，2015年为3.08%，2016年为5.26%，2017年为12.67%（表1）。在样品来源的267个猪场中，检出PCV3阳性猪场35个，猪场阳性率为13.11%。2014年和2015年猪场阳性率较低，分别为4.55%和5.13%；2016年升高到12.09%；2017年达到25.00%（表2）。16份PCV3阳性样品的PCR扩增序列与PCV3/US/SD2016株的同源性为98.4%～99.6%，与PCV3/CN/Hubei-618株的同源性为99.0%～99.8%，16株病毒之间的同源性为98.3%～100%（表3）。

表1 2014～2017年病猪临床样品PCV3检测结果统计表Table 1 PCV3 test statistics of diseased pig clinical samples from 2014 to 2017

表2 2014～2017年猪场PCV3阳性统计表Table 2 PCV3 positive rate of pig farms from 2014 to 2017

3 讨论

本研究建立了检测PCV3的PCR方法。经临床样品检测，证明该方法特异性强、敏感性高、重复性好，可以作为一种操作简便、费用低廉的检测方法，从而得以推广应用。在试验过程中，我们比较了多对引物（包括已报道的引物[4]），PCR结果显示，本方法中所使用的引物扩增效率高，阳性条带更清晰，且杂带少，更适用于临床样品中PCV3的核酸检测。本方法用普通2×mix可检测到的最低质粒浓度达到10 copy/μL，而用金牌Mix（green）甚至偶可检测到1 copy/μL，高于徐朋丽等[7]报道的方

法。PCR特异性试验中，对PCV1、PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、PPV均扩增不出目的片段，而PRV会出现较弱的大小约为350 bp的非特异性条带，但由于其大小明显小于PCV3扩增片段，不会干扰PCV3的结果判定。

表3 16份PCV3阳性样品的PCR扩增序列同源性比较Table 3 Comparison of amplif i cation sequences of 16 PCV3 positive samples

江苏省2014～2017年的临床发病猪及健康猪样品的PCR检测结果显示，病猪（PMWS/PRDC/腹泻）PCV3的检出率明显高于健康猪，表明PCV3可能与这些疫病的发生有一定的关系。从时间上看，2014年，江苏猪群中PCV3猪场阳性率和样品阳性率分别只有4.55%和1.92%，其后，阳性率逐年递增，至2017年分别达到25.00%和12.67%。该结果与Wang等[8]的报道基本一致。PCV3的这种流行趋势值得高度重视。

Fan等[9]和Shen等[10]分别对中国PCV3毒株的全长序列与PCV3/US/SD2016株进行了同源性分析，结果显示中国PCV3/CN/Hubei-618、PCV3/China/GD2016毒株与PCV3/US/SD2016株的同源性分别为99.1%～99.6%和97.4%～98.5%。本研究对16个样品的PCV3扩增片段进行了序列测定，同源性比较结果显示，所测各毒株之间的核苷酸序列同源性为98.3%～100%；与PCV3/US/SD2016株的同源性为98.4%～99.6%；与PCV3/CN/Hubei-618株的同源性为99.0%～99.8%。不同年份的毒株之间的同源性差异无明显规律性。表明PCV3毒株之间存在一定的变异，但其变异与地域及年份并无直接关系。

参考文献

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[6] Ku X, Chen F, Li P,et al. Identification and genetic characterization of porcine circovirus type 3 in China[J].Transbound Emerg Dis, 2017, 64(3)： 703-708.

[7] 徐朋丽, 张鸿鑫, 张宇, 等. 猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立及应用[J]. 中国预防兽医学报, 2017, 39(9)： 727-730.

[8] Wang J, Zhang Y, Wang J,et al. Development of a TaqMan-based real-time PCR assay for the specific detection of porcine circovirsu 3[J]. J Virol Methods,2017, 248：177-180.

[9] Fan S, Ku X, Chen F,et al. Complete genome sequence of a novel porcine circovirus type 3 strain, PCV3/CN/Hubei-618/2016, isolated from China[J]. Genome Announc, 2017, 13, 5(15). pii： e00100-17.

[10] Shen H, Liu X, Zhang P,et al. Genome characterization of a porcine circovirus type 3 in South China[J].Transbound Emerg Dis, 2018, 65(1)： 264-266.