肝病实脾法对急性肝损伤小鼠肝抗氧化能力的影响

2018-04-24林振昆曾友强李秀娟殷娉宇郭明章

福建中医药 2018年2期

王洋，林振昆，曾友强，李秀娟，殷娉宇，郭明章

（福建中医药大学中医学院，福建福州 350122）

实脾法是中医药治疗肝病的一个重要治法，早在《难经》《金匮要略》中就提出了“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”的观点，该治法体现了中医治病的整体观和治未病的思想，其强调“实脾”的观点对现代临床治疗肝病具有重要的指导意义，但该治法对肝损伤防治作用的影响机制尚在探讨。益气健脾法是中医治疗肝病中常用的“实脾”法之一［1-5］。本研究用健脾益气方四君子汤与治疗肝病的常用经方四逆散，分别单方使用、两方合用做为造模前的治疗性干预用药，拟采用尾静脉注射刀豆蛋白（ConA）法建立小鼠急性肝损伤模型，探讨肝病实脾法对急性肝损伤小鼠肝抗氧化能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级6～8周龄健康BALB／C雄性小鼠50只，体重（20±2）g，上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCK（沪）2012-0002。

1.1.2 药物及制备四君子汤、四逆散、四君子汤与四逆散合方均按《方剂学》［6］规定的剂量比例称取。四君子汤组成：党参10 g，白术10 g，茯苓10 g，炙甘草5 g；四逆散组成：柴胡10 g，赤芍10 g，枳壳10 g，炙甘草5 g。四君子汤与四逆散组即以上两方剂量合用。以上均按传统方法水煎，煎煮2次，取2次水煎液合并后浓缩成含生药量约1 g／mL，置4℃保存备用。

1.1.3 试剂与仪器 ConA（德国Sigma公司）；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、血清丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Infinite M200多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；3K15低温离心机（德国Sigma公司）；AE100电子天平（瑞士METTLER-TOLEDO公司）。

1.2 模型制备及给药方法 50只BALB／C雄性小鼠随机分成5个组，每组10只，分别为对照组、模型组、四君子汤组、四逆散组、四君子汤合四逆散组。在造模前对各组给予灌胃给药，给药剂量为0.02 mL／g鼠重。其中对照组、模型组给予蒸馏水灌胃，四君子组给予四君子汤浓缩液，四逆散组给予四逆散汤浓缩液，四君子汤合四逆散组给予四君子汤合四逆散汤浓缩液，每天1次，连续给药4 d。在最后1次给药后4 h造模，行静脉注射2 mg／mL ConA 0.2 mL／只，ConA溶解于1×PBS里，以诱导肝损伤，其中正常组小鼠均给予尾静脉注射PBS 2 mL／只［7－8］。各组小鼠于造模后6 h行目内眦静脉丛取血，颈椎脱臼处死，解剖动物取部分肝组织剪碎，置于液氮中固定后，于-80℃保存。

1.3 血清AST、ALT、NO测定实验中通过目内眦静脉丛取血，全血离心，取上清液，按照AST、ALT、NO试剂盒进行测定。

1.4 肝组织匀浆MDA、SOD、GSH测定准确称取于-80℃保存的小鼠肝脏，加入9倍预冷的生理盐水，匀浆，离心后取上清液，按 MDA、SOD、GSH试剂盒说明书进行测试，同时测定小鼠肝脏的蛋白质含量（考马斯亮蓝法）。

1.5 统计学方法采用SPSS20.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布以（x±s）表示，采用t检验，不符合正态分布采用非参数检验。

2 结果

2.1 各组小鼠血清ALT、AST、NO比较

2.2 各组小鼠肝组织匀浆MDA、SOD、GSH比较

表1 各组小鼠血清ALT、AST、NO比较（x±s）

表2 各组小鼠肝组织匀浆MDA、SOD、GSH比较（x±s）

3 讨论

根据中医理论，生理状态下肝木能对脾土行使疏泄条达之能，脾胃之气升降畅通，运化水谷精微也可滋养肝木，构成肝脾生理功能的协调。一旦肝失疏泄而肝气郁结，横逆犯脾，会导致脾胃虚弱，而脾胃功能的失调也影响了肝疏泄条达机能的恢复。本实验中以四逆散方做为常规治疗肝病的治肝方，四逆散是疏肝理气的常用经方，具有调理气机，宣通郁滞，解郁开结，益气生新的功效，在临床上常用于治疗病毒性肝炎，近来亦有实验研究表明四逆散有良好的抗肝损伤作用［9-10］，而四君子汤是中医传统名方，具有健脾益气之功效，常在肝病治疗中做为实脾法运用。而ConA诱导的小鼠急性免疫性肝损伤模型，被认为能够较好地模拟人类病毒性肝炎等免疫性肝病的病理变化，常应用于其发病机理及其治疗药物的作用机制研究［11-12］。本研究采用了ConA诱导的小鼠急性免疫性肝损伤模型，并以四君子汤方做为实脾法的代表方，同时设了一组四君子汤与四逆散的合方以探讨肝病实脾法对急性肝损伤小鼠肝组织抗氧化能力是否具有保护作用。

血清中ALT和AST的水平是代表肝脏损伤的程度。NO在肝损伤过程中有双重作用，研究表明：NO在肝损伤过程中早期可对肝脏起保护作用；但当NO在肝脏中的浓度远远高于其生理浓度时，则其可通过抑制线粒体呼吸、抑制肝细胞蛋白质的合成，导致肝细胞的DNA断裂、肝组织细胞脂质过氧化和细胞毒性损伤，间接改变细胞内的cAMP含量、使肝细胞对TNF-α敏感性的提高等机制造成肝细胞损害、坏死。MDA是氧化应激状态下产生的重要的脂质过氧化产物，可趋化中性粒细胞，还可导致致炎因子表达和释放增加而产生炎症，其水平高低反映了脂质过氧化导致肝损伤的程度［13］。在本研究中模型组的小鼠血清中ALT、AST、NO及肝组织中的MDA水平较正常组、对照组显著升高，说明因ConA的诱导造成了小鼠严重的肝损伤。而四君子汤、四逆散、四君子汤合四逆散合方均使血清中ALT、AST、NO和肝组织中MDA水平降低，并且这4个指标在3个治疗组间也部分存在显著性差异，说明实脾法和疏肝理气法对免疫性肝损伤中的ALT、AST、NO、MDA水平能起到降低的作用，而健脾益气方与治肝方联合使用时疗效更为显著，符合中医的在肝病治疗中同时运用实脾法能提高疗效的理论。

SOD和GSH都是肝组织中重要的抗氧化酶，在减轻肝组织过氧化损伤中起到重要作用。SOD能清除超氧阴离子自由基而保护细胞，是生物体内第一道抗氧化防御体系。当肝细胞受到自由基攻击时，通过SOD与自由基作用而减少肝细胞的损伤。同时SOD还与体内的第二道乃至更多的抗氧化防御体系有机的配合，以减少细胞损伤。GSH可直接通过供H＋拮抗氧自由基毒性，清除体内的超氧离子及其他自由基，防止肝细胞损伤。因GSH具有强大的还原作用而使肝细胞膜对氧自由基的耐受性增加，从而保护肝细胞膜，使肝细胞膜稳定性增加、肝酶降低。

本研究中小鼠肝组织的GSH水平与正常对照组相比，仅四君子汤合四逆散组有显著降低，其余各组均无显著差异，这可能与急性肝损伤所造成的免疫反应时间尚短，体内GSH消耗不太明显有关。而健脾益气方与治肝方联合使用，能提高GSH的抗氧化能力，加速GSH的损耗，所以导致其GSH水平下降明显，这可能也是健脾益气方与治肝方联合使用能有效降低ALT、AST、NO、MDA水平的原因。但在肝损伤持续时间较长的情况中，肝病实脾法能否提高肝脏中抗氧化酶的水平还需做进一步探讨。

参考文献：

［1］王荣国.加味四君子汤联合拉米夫定治疗慢性乙型肝炎疗效观察［J］.实用中西医结合临床，2010，10（5）：11-12.

［2］魏常胜，王宇，薛建国，等.丹柴四君子汤对大鼠肝硬化中肝线粒体保护作用的实验研究［J］.中华肝胆外科杂志，2004，10（9）：623-626.

［3］华晨，傅永清，傅天啸，等.四君子汤联合缺血预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护作用的研究［J］.浙江实用医学，2014，19（2）：83-86.

［4］张家炎.四逆散合四君子汤联合西药治疗慢性乙肝肝纤维化随机平行对照研究［J］.实用中医内科杂志，2013，27（2）：81-82.

［5］李恒飞.茵陈四君子汤治疗重症肝炎临床观察［J］.湖北中医杂志，2012，34（2）：13-14.

［6］李冀.方剂学［M］.北京：中国中医药出版社，2012.

［7］刘悦晖，范学工，李宁，等.刀豆球蛋白A所致实验性肝损伤模型的构建［J］.中国感染控制杂志，2008，（5）：297-301.

［8］陈诗慧，黄俊婷.加味四逆散对刀豆蛋白A所致免疫性肝损伤的保护作用［J］.中国热带医学，2007，7（5）：700-701.

［9］陈永春.从“传脾，实脾”角度谈慢性肝炎的辨证论治［J］.中西医结合肝病杂志，2010，20（6）：368-373.

［10］罗春霞.四逆散合四君子汤治疗乙型肝炎肝硬变39例［J］.河南中医，2015，35（2）：293-294.

［11］李敏，李卫东.ConA引起小鼠肝损伤实验研究［J］.中国比较医学杂志，2008，18（7）：13-17.