山药多糖对小鼠肝缺血再灌注损伤中的肝脾组织的保护作用＊

宋俊杰，陈 英，范军朝，王丹丹，毛珊珊，郑孝振，王 莹

肝缺血再灌注损伤 （hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）是肝细胞和组织在缺血或缺氧一段时间后，恢复血流不但不会使其功能得到恢复，反而会加剧肝损害。在肝外科，为了减少手术过程中的出血，常阻断第一肝门，这势必造成肝缺血性损伤，而后开放肝门，又不可避免地造成肝缺血后的再灌注损伤。药物预处理能增强细胞和组织对缺血再灌注损伤的抵抗力。但很多药物具有很高的毒性，而中草药具有安全范围大，毒性作用小等优势，可以从多层次、多方面对缺血再灌注损伤起到保护作用，因此成为缺血再灌注损伤所关注的研究对象。

中药材山药具有提高免疫功能、抗氧化、降血脂、延缓衰老等药理作用，山药多糖是山药的有效成分，是从山药块根中提取而来的。在四氯化碳所致的小鼠急性肝损伤的模型中，肝组织的病理损害明显减轻，同时肝组织超氧化物歧化酶（SOD）的活性明显增加，丙二醛（MDA）的含量明显降低［1，2］。 在卡介苗与脂多糖诱导的小鼠免疫性肝损伤的研究中，中剂量（60 mg/kg）及高剂量（120 mg/kg）的山药多糖均降低了小鼠的肝指数、脾指数，但此研究未报道二者对肝组织病理学的影响［3，4］。目前，尚未发现山药多糖对肝缺血再灌注损伤方面的研究。该研究通过观察山药多糖对小鼠肝缺血再灌注损伤肝、脾组织学的影响，为进一步探讨山药多糖对肝缺血再灌注损伤的保护机制提供支持。

1 材料与方法

1.1 动物及材料 SPF级KM小鼠，雄性，32只，体质量20～40 g，购自河南省动物实验中心，合格证：SCXK（豫）2010-0002。动物饲料20 kg，购自河南省动物实验中心。所有小鼠饲养于河南大学第一附属医院肿瘤分子免疫实验室，环境清洁，温度17～23℃，相对湿度45%～55%，光照随昼夜变化，自由饮水、摄食。

山药多糖，纯度99%，购自杨凌慈缘生物技术有限公司。戊巴比妥钠，规格：5 g，北京普博斯生物科技有限公司。注射用生理盐水。

该研究的实验程序及方案均得到河南大学动物伦理委员会的批准。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 小鼠适应性饲养1 W后，采用完全随机的方法，分为对照组（C组，n=8）；盐水+HIRI组（N 组，n=8）；山药多糖中剂量+HIRI组（M 组，n=8）；山药多糖高剂量+HIRI组（H 组，n=8）。 山药多糖中剂量为60 mg/kg，高剂量为120 mg/kg。在缺血再灌注模型制作前分别给予不同剂量的山药多糖溶液灌胃，1次/d，共14 d。对照组给予等量的生理盐水，并且只开胸，不建立缺血模型。

1.2.2 动物模型建立 所有小鼠均于手术前12 h开始禁食，可自由饮水。电子天平进行准确称重后，以50 mg/kg的戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉。当小鼠倒卧在地、麻醉充分后，取仰卧位，将其四肢及门牙固定于洁净手术操作台上，对小鼠腹部手术区域进行常规备皮；然后络合碘消毒，共3遍，铺无菌手术单。取腹部剑突下至耻骨联合上取正中切口，游离出肝胃韧带，暴露出第一肝门，用无创伤微血管夹钳夹肝蒂（包括门静脉、肝动脉、胆总管等）造成肝缺血。完全夹闭后，即可见肝叶的颜色由鲜红色转变为暗红色至灰白、质地变软，肠管因瘀血转为青紫色 （上述现象表明肝缺血成功建立）。准确计时，将肝、肠管轻柔归位，手术切口合拢后用温盐水纱布覆盖。缺血30 min后，小心取出无损伤血管夹，避免撕裂血管，松动钳夹的组织，使肝血供恢复，可见肝叶由苍白转为红润、肠道淤血好转，此时表明再灌注成功建立。复位腹腔脏器，然后用丝线缝合切口，关腹、消毒，即完成小鼠肝缺血再灌注模型制作。此模型制作采用了经典的肝缺血再灌注损伤模型的方法［13］。该研究中正常对照组只开腹，30 min后关腹。术后将所有小鼠放置于电热毯上复苏，苏醒后自由饮水。

与再灌注24 h后称重，再次以50 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。于小鼠腹部正中纵行切开，充分暴露腹腔内脏器，分别辨认并取出完整的肝和脾，4℃生理盐水清洗表面，用滤纸吸干表面水分，称脾重和肝重。取右侧部分肝以及肾置于4%的多聚甲醛溶液中固定后以待病理学观察。

1.2.3 观察和检测指标 （1）体质量。每次给药前称重，并观察小鼠的体态改变，称取小鼠体质量，并记录。（2）肝指数和脾指数。肝指数和脾指数计算公式如下：肝指数（%）=肝质量（g）/体质量（g）×100%；脾指数（%）=脾质量（g）/体质量（g）×100%。 （3）肝和脾组织病理学改变。将固定后标本经脱水、透明、浸蜡、包埋、染色、封片等处理后，由有经验的病理学医师在显微镜下观察肝和脾的结构变化。肝组织病理学评分参照叶秀娣等的评分标准［2］。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行统计学分析，所有计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体质量 各组间及组内体质量比较，差异无明显变化（P＞0.05）。

2.2 肝和脾指数 与N组相比，M组及H组的肝指数降低且有统计学意义（P＜0.05）。与C组相比，N组的脾指数增大有统计学意义（P＜0.05）；与N组相比，M组和H组的脾指数均降低，但M组的脾指数降低有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组肝和脾指数（x±s）

2.3 肝组织病理学 C组：结构清晰，未见变性肝细胞；N组：结构不清，核碎裂多见，胞质空泡样变多见；M组：大部分结构不清，可见部分核碎裂，部分胞质空泡样变；H组：大部分结构清晰，部分排列紊乱，核碎裂少见，空泡样变少见。见图1。

图1 肝病理学变化（×100）

2.4 肝组织病理评分 与C组比较，N组的组织病理学评分升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与N组比较，M组和H组的肝组织病理评分降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见图 2。

图2 肝组织病理评分

2.5 脾组织病理学 C组：正常脾组织，红髓和白髓可分辨，未见脾窦充血；N组：脾小节结构不清，白髓不明显，脾窦充血；M组：可分辨出红、白髓，部分脾小节结构不清，部分脾窦充血；H组：可分辨出红、白髓，脾小节结构基本正常。见图3。

图3 脾组织病理学（×40）

3 讨论

在肝外科，为了减少术中出血，常阻断第一肝门，这势必造成肝缺血，恢复血流再灌注后不但不会使其功能得到恢复，反而会加剧肝损害。药物预先处理能增强细胞和组织对缺血再灌注损伤的抵抗力。山药多糖是中药材山药的有效成分，是从山药块根中提取而来的。在四氯化碳所致的小鼠急性肝损伤模型中，山药提取物明显减轻了肝组织病理学损害［1］。 此外，在四氯化碳所致的肝损伤中［3］，山药多糖保护组降低了肝体指数。山药多糖对卡介苗与脂多糖诱导的小鼠免疫性肝损伤的研究中也发现，山药多糖各剂量组均降低了小鼠肝指数、脾指数及血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、丙二醛（MDA）的含量，同时增加了还原性谷胱甘肽（GSH）的含量和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性［4］。但是，目前，尚未发现山药多糖对缺血性肝损伤的保护作用。

脾是机体的重要免疫器官［5］，也是免疫细胞储存和定居的主要场所，它由白髓、红髓和边缘区构成。脾在机体的免疫应答方面发挥着巨大的作用，它是对进入血液的抗原性物质产生免疫应答的重要部位，无论是体液免疫还是细胞免疫均可导致脾组织结构的变化。故而，脾大（体积和质量的增加）或脾指数的增长在一定程度上反映了脾结构及功能的变化［6，7］。 肝门静脉血液回流受阻时，可造成充血性脾肿大，脾窦扩张，脾内纤维组织增生。本实验中，由于暂时阻断了肝门静脉，因此造成了脾的充血肿大，与C组相比，N组的脾指数增大有统计学意义（P＜0.05）；与N组相比，M组和H组的脾指数均降低，但M组的脾指数降低有统计学意义 （P＜0.05）。

另外，脾组织病理学结果显示，N组：脾小节结构不清，白髓不明显，脾窦充血；M组：可分辨出红、白髓，部分脾小节结构不清，部分脾窦充血；H组：可分辨出红、白髓，脾小节结构基本正常。以上结果表明，肝缺血再灌注损伤造成了小鼠脾病理学损伤和脾指数升高，中剂量和高剂量的山药多糖改善了肝缺血再灌注损伤过程中的脾组织病理学损伤，且以高剂量的山药多糖较为明显。

肝是人体重要的解毒器官，因此保护肝有重要意义，肝指数可反映肝组织的病变情况。本研究发现，与N组相比，M组及H组的肝指数降低且有统计学意义（P＜0.05），并且高剂量山药多糖组升高较明显。很多研究均表明，山药多糖能改善肝指数，减轻肝损伤［3，8］。山药多糖对卡介苗与脂多糖诱导的小鼠免疫性肝损伤的研究表明，山药多糖各剂量组小鼠肝指数均降低［3］。对于镉所致的肝损伤，山药多糖也降低了肝指数［9-11］。该研究中，肝组织病理学结果显示，C组：肝组织结构清晰，未见变性肝细胞；N组：肝组织结构不清，核碎裂多见，胞质空泡样变多见；M组：肝组织大部分结构不清，可见部分核碎裂，部分胞质空泡样变；H组：肝组织大部分结构清晰，部分排列紊乱，核碎裂少见，空泡样变少见。肝组织病理学评分也显示，与肝缺血组相比，中剂量及高剂量三药多糖组的肝组织病理学损伤均明显减轻。另有研究表明，在四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤中，山药多糖组肝小叶结构清晰［12］。由此，说明山药多糖对肝组织损伤有保护作用。

总结，该研究主要从形态学方面证实在小鼠肝缺血再灌注损伤的模型中，中剂量及高剂量的山药多糖对肝损伤和脾损伤有保护作用。

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［2017－12－06 收稿，2018－01－03 修回］