TUNEL法检测自拟复方葛根片对老龄大鼠子宫的保护作用

陶 利，王飞飞，李云江，张淑瑜，毕云生，于燕莉，徐建江

复方葛根片［1］是原济南军区总医院的医院制剂，处方是由葛根、丹参、茵陈和延胡索四种中药组成的，具有活血化瘀、生津养心的功效，临床上主要用作冠心病、心绞痛以及心肌梗死等的治疗。随着年龄增长，子宫组织及功能退化，影响身体健康。该实验通过测定血清中雌激素水平［2，3］，以及采用TUNEL法［4］，对老龄大鼠的子宫进行细胞凋亡情况检测，来研究复方葛根片对老龄大鼠子宫的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料及仪器 复方葛根片（原济南军区总医院，批号：20151212，规格：0.4 g/片）；D-半乳糖（张家港市华昌药业有限公司，批号：15121101，纯度：≥98%），0.9%氯化钠注射液（山东齐都药业有限公司，批号：8B15101306）；TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒 （批号：20161128）、Triton X-100 （批号：1286C380）、即用型 DAPI染色液（批号：20161222）均购于南京凯基生物科技发展有限公司；雌二醇（批号 CK-E30594R）、促卵泡激素 （批号：CKE30608R）、促黄体生成素（批号：CK-E30597R）、泌乳素（批号；CK-E30623R）试剂盒均购于上海源叶生物科技有限公司。

1.1.2 实验动物 健康大鼠（Wistar）共40只，♀，体质量 200～250 g，动物许可证号：SCXK（鲁）2013-0009，由山东大学实验动物中心提供。实验前，稳定饲养7 d，饲养环境：湿度 50%～70%，温度25～27℃（室温），自然光照。

1.2 方 法

1.2.1 D-半乳糖造模 40只大鼠，随机分成5个组即：正常组、模型组、复方葛根片低、中、高剂量组，每组8只。以腹腔注射D-半乳糖溶液，来复制衰老模型，用药剂量为250 mg/kg·d，D-半乳糖溶液由0.9%生理盐水配制而成。正常组给予相同体积的生理盐水。同时，复方葛根片高、中、低剂量组分别给予 1.35 g/kg、0.90 g/kg、0.45 g/kg的剂量， 给药剂量按中药药理研究方法学计算［5］，药品临用前加纯化水溶解，给药剂量：10 ml/kg；正常组与模型组灌胃给予等量的纯化水。连续用药8周，称量大鼠的体质量，1次/7 d，以便调整给药剂量。

1.2.2 各组大鼠指标检测 末次给药以后，各组大鼠12 h内禁食、不禁水，麻醉，腹腔静脉取血，4℃离心（离心半径为 5 cm，3 000 r/min）20 min，采集血清，-20℃保存，备用；摘取子宫，冰生理盐水清洗，切割称重，-80℃保存，备用。按照试剂盒说明书操作测定血清中雌二醇（E2）浓度、促卵泡激素（FSH）浓度、促黄体生成素（LH）浓度、泌乳素（PRL）浓度，并根据试剂盒说明书，对子宫切片进行TRITC染色，检测细胞的凋亡情况。

1.2.3 图像采集与分析 采用荧光显微镜观察各组大鼠的子宫组织切片，并采用数字成像系统进行拍照。利用Image Por-plus6.0图像分析软件，计数阳性细胞和区域内总细胞数量，计算阳性细胞所占百分比，即凋亡指数（apoptotic index，AI）。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件对所测得得数据进行统计分析。所有数据均以x±s表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 复方葛根片对血清E2、FSH、LH、PRL的影响与正常组比较，模型组大鼠血清E2浓度明显降低，FSH、PRL、LH 浓度显著升高（P＜0.01）；衰老模型建造成功；与模型组比较，复方葛根片各用药剂量组大鼠 E2 浓度明显升高（P＜0.05），FSH、PRL、LH浓度显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。 见表 1。

表1 对去卵巢更年期大鼠血清E2、FSH、LH、PRL的影响（x±s，n=8）

与正常组比较，模型组大鼠血清E2浓度明显降低，FSH、PRL、LH 浓度显著升高（P＜0.01）；衰老模型建造成功；与模型组比较，复方葛根片各用药剂量组大鼠 E2 浓度明显升高（P＜0.05），FSH、PRL、LH 浓度显著显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。

2.2 子宫细胞凋亡检测结果 图1中红色荧光代表凋亡细胞。阳性组（A）为阳性对照组（通透操作之后，阳性片单独滴加100 μl DNaseⅠ反应液，37℃，处理30 min），全部显示为红色荧光，表示所有的细胞均被染色；阴性组（B）为阴性对照组（通透之后直接进行检测），全部不显示荧光；与阳性组（A）和阴性组（B）相比，模型组（C）、正常组（D）、复方葛根片高、中、低剂量组（E、F、G）中均显示红色荧光，表明该实验结果有效。与正常组（D）相比，模型组（C）荧光明显增强，荧光区域明显增大，且呈点线状分布，细胞凋亡指数（AI）明显升高（P＜0.05），表明造模成功。与模型组（C）相比，复方葛根片高、中、低剂量组（E、F、G）中红色荧光均显著减弱，荧光区域减小，呈星点状分布，细胞凋亡指数（AI）明显降低（P＜0.05或P＜0.01），差异显著，有统计学意义。其中低剂量组（G）中荧光比高剂量组（E）相对较多且明亮，高剂量组（E）中荧光点最少，几乎不可见。表明复方葛根片有明显的抑制衰老大鼠子宫细胞凋亡的作用。见图 1，表 2。

图1 各组大鼠肝脏组织细胞凋亡检测结果（×200）

表2 各组大鼠子宫细胞凋亡率结果（n=8，x±s）

3 讨论

雌激素是促进女性附性器官成熟及第二性征出现，并维持正常性欲及生殖功能的激素。随着年龄的增长，雌激素的水平会不断发生变化［6，7］。 老龄大鼠由于卵巢功能的退化，E2水平会明显降低，而雌激素对垂体促性腺激素的分泌和合成呈负反馈作用。雌激素水平的下降，诱导下丘脑弓状核和室旁核脉冲式分泌促性腺激素释放激素至门脉循环，进而刺激垂体释放FSH和LH增加，从而促进PRL的分泌。实验研究结果显示，模型组中E2浓度明显下降，FSH、LH、PRL浓度明显升高，表明衰老模型造模成功；与模型组相比，复方葛根片各用药组中E2浓度升高，FSH、LH、PRL浓度出现不同程度的下降。表明复方葛根片能有效调节雌激素水平。

通过荧光显微镜观察，对子宫组织切片进行TUNEL法［8］染色，其细胞凋亡的检测结果显示，模型组中显示大量的明亮荧光，表明凋亡细胞数量增多；与正常组相比，模型组中荧光点明显增多且光点密集，凋亡指数（AI）明显增加，说明通过D-半乳糖制造衰老模型［9］，造模成功。复方葛根片高、中、低剂量组切片中荧光点减少，凋亡指数（AI）与模型组相比显著降低。表明复方葛根片能够抑制老龄雌性大鼠子宫中凋亡细胞的产生，延缓子宫衰老。

以上数据表明复方葛根片能有效抑制子宫细胞凋亡，并调节雌激素水平，起到延缓衰老，保护子宫的作用。

［1］于燕莉，梁爱君，张莉，等.复方葛根片的质量标准研究［J］.解放军药学学报，2009，25（6）：524-526.

［2］周智君，俞远京，丁志刚，等.大豆异黄酮对老龄大鼠雌激素水平和子宫雌激素受体表达的影响［J］.中国实验动物学报，2009，17（4）：288-291.

［3］常伟勤，宋昕恬，孟令仪，等.人参粉对长期喂养去卵巢大鼠内分泌功能影响初探［J］.中国实验诊断学，2017，21（4）：698-701.

［4］郭晓红，刘立新.AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法和TUNEL法检测肝细胞凋亡的对比研究［J］.山西医科大学学报，2008，187（5）：476-479.

［5］陈奇.中药药理研究方法学［M］.第2版.北京：人民卫生出版社，2006：31.

［6］戚本玲，戚本明.葛根提取物对正常及去势大鼠血清雌激素水平影响的研究［J］. 中国中医药杂志，2002，27（11）：850-851.

［7］王玉双，张国瑞，刘艳君，等.大豆异黄酮对女性围绝经期综合征及性激素的影响［J］. 中国综合临床，2006，22（1）：86-88.

［8］张素阁，王飞飞，张云凯，等.TUNEL法检测复方葛根片对衰老模型大鼠肝脏细胞的保护作用［J］.解放军药学学报，2017，33（4）：345-347.

［9］李树梅，卢胜明，康峰，等.衰老动物模型的研究进展及应用［J］.中国老年学杂志，2011，31（19）：3869-3872.

［2017-12-29收稿，2018-01-25修回］