Mirco-CT对纳米细菌大鼠肾结石的动态观测＊

郝志强，王勤章，倪 钊，钱 成，申茂磊，钱 彪

肾结石一直以来都是泌尿外科的常见病、多发病，根据我国2010年全国人口普查资料显示，校正后的中国成人肾结石患病率为5.8%，其中男性患病率为6.5%，女性患病率为5.1%。临床上对于肾结石这一疾病的研究从未中断，大都通过构建肾结石动物模型，对其病因学进行探索。既往动物模型的构建大多采用乙二醇、氯化铵等传统造模方式，对模型肾功能损害较大。本课题组前期发现肾结石患者患侧中段尿培养纳米细菌阳性，而健侧阴性，纳米细菌（nanobacteria，NB）可能是肾结石发病的原因之一，为验证NB与肾结石的关系。本课题采用NB诱导Wistar雄性大鼠，成功制备了肾结石模型，而后，利用目前在探索高密度物质中先进的手段——微计算机断层扫描技术（micro computed tomography，mirco-CT）［1］，对 Wistar大鼠肾结石模型进行动态观测，实时记录模型体内结石的形成发展过程，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验动物：选取Wistar雄性大鼠60只，购自新疆医科大学实验动物中心，SPF级［合格证号SCXK（新）2013-0001］，两组大鼠均先适应性饲养1周，标准饲料喂养，饲料来源：石河子大学实验动物中心。

实验器械：多功能光学显微镜及图像采集系统（BX40， 日本 Olympus公司）、Mirco-CT （sky-scan 1176，比利时 Antwerpen）。

实验试剂：纳米细菌悬浊液、0.9%生理盐水等。

1.2 方 法

1.2.1 纳米细菌的制备 纳米细菌来源于肾结石患者清洁中段晨尿，收集标本后提取并培养，具体操作如下：收集标本5 ml，生理盐水稀释2倍后滤器过滤、离心取管底液1 ml，加入DMEM及热灭活胎牛血清培养，5%CO2，37℃，28～30 d 换液 1 次，培养6～8周，30 d换液一次。筛选出无污染的标本制成NB悬液。

1.2.2 动物模型的建立及实验取材 将60只SPF级Wistar雄性大鼠随机分为纳米细菌组（尾静脉注射1.2 ml NB悬液，30只）和对照组（尾静脉注射1.2 ml生理盐水，30只），共计处理10 W，每周每组处死3只，并取两侧鲜活肾标本，进行检测。

1.2.3 Mirco-CT扫描 将获得的标本固定放置在放射源和摄像头之间并使标本在观察通道范围内可见，然后设置观察通道沿垂直长轴作0.9°至180°旋转，在整个扫描视野范围中，使用mirco-CT对固定后肾进行扫描，在skyscan软件系统下设置如下扫描条件：功率 8 W、电压 30 kV，电流 300 μA，分辨率 35 μm 2000×1336，Filter=0.5 mmAL，观察肾整体轮廓及肾中肾皮质及肾髓质是否存在高密度结石样物质，并进行拍照记录及三维平面重建，若双侧标本均同时出现高密度区，仅统计1次，计数10 W内每周检测到的高密度影个数。

1.2.4 病理组织学检查 取得标本后，依次经过固定、脱水透明、浸蜡包埋、切片贴片、脱蜡染色、脱水透明、封固等步骤，制得Wistar大鼠NB肾结石模型病理切片，在光学显微镜下观察晶体的形成过程，依据相关文献提供的肾结晶分级判定标准进行统计，0级记为阴性，Ⅰ～Ⅳ级记为阳性，进行综合、统计。

1.3 统计学方法 实验所得数据，应用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mirco－CT检查结果 动态观测1～10 W两组所获得标本，对照组大鼠肾外周轮廓清晰，边缘光滑无毛糙；三视图图像中肾皮质、肾髓质及肾盂轮廓清晰可见，均未见高密度影，见图1。纳米细菌组大鼠第6周起肾可见高密度区，颗粒样高密度影分布于肾实质中，三视图图像可见高密度颗粒状影随机分布于肾实质的各截面中，见图2。截至第10周末，纳米细菌组大鼠肾高密度影检出4只（阳性率13.3%），对照组未检出。

图1 对照组micro-CT检测结果

图2 纳米细菌组micro-CT检测结果

2.2 肉眼及解剖显微镜观察 取大鼠双侧肾标本，肉眼观，对照组大鼠肾表面光滑，剖面呈现暗红色，皮髓结构清晰，未见明显斑点颗粒；纳米细菌组从第4周开始，部分肾较对照组略有增大，剖面呈红褐色，髓质呈浅红色，皮髓结构清晰，肾盏及肾盂良好；第6周以后纳米细菌组部分肾皮髓结构尚清晰，但有少量散在淡黄色颗粒沉积在肾组织中，触之有沙砾感。镜下观测，对照组无异常，纳米细菌组可见晶体自肾盂向周围呈点状分布。

2.3 病理组织学检查结果 动态观测1～10 W两组Wistar大鼠肾标本，对照组大鼠肾内无晶体沉积，未见明显病理学改变（图3）。纳米细菌组大鼠自第4周起，其肾病理切片可见灰白色晶体，这些晶体主要分布于远曲小管、近曲小管及部分肾小球，形态不一，呈散点状分布，部分晶体相互连接成片或成团分布（图4）。10 W时计数，纳米细菌组大鼠肾晶体阳性11只 （阳性率36.7%），对照组均为阴性；截至第10周末，纳米细菌组大鼠肾晶体阳性率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.001）。

图3 对照组

图4 纳米细菌组

3 讨论

肾结石是泌尿外科诊疗中的常见病之一，治疗手段多种多样，各种治疗方法，很大程度上均可以缓解患者的病痛，但该疾病较容易复发。有研究表明，经体外冲击波碎石技术治疗后的泌尿系结石患者的结石复发率随着时间增长而有所升高，其中第1年复发率为6.7%，至第5年则增长到41.8%［2］。面对如此情况，众多科研工作者积极致力于肾结石病因学的研究，在实验设计时，大都采用构建动物模型这一方式。以往多采用乙二醇、氯化铵进行诱导实验动物，构建肾结石模型，但这种方式对肾功能损伤较大，成石较快，不利于进行动态监测。因此，设计、建立与人类肾结石成石过程相类似的动物模型，在相对缓慢的成石过程中，动态观测研究，对于探讨肾结石的发病机制，预防和延缓结石形成，寻找防治肾结石的药物等方面就有重要的意义，据目前的资料显示，NB是人体内唯一可以产生羟基磷灰石的生物，探究其在结石形成过程中的机制，成为当前解决结石形成这一问题的新方向。

NB是芬兰科学家Ciftcioglu等［3］在哺乳动物细胞培养时发现的一种具有细胞毒作用的生物被膜的生物，并在此后检测出该生物被膜中包含了一种可能是含有基因序列为16sr RNA的颗粒物质［4］。

随着对纳米细菌各项生物学特性的不断了解，人们发现NB在泌尿系结石的发生发展过程中扮演着重要角色，NB所特有的生物矿化功能［5］在临床许多钙化性疾病中都得到了有效验证，NB作为钙化的核心［6，7］，并进一步促进了钙化的发展。 并且国内外众多学者通过免疫荧光、钙染色、相差显微镜、电镜等方法在人体体液及许多组织器官中检测到了纳米细菌的存在，NB作为矿化反应的始作俑者，在吸引并聚集的同时，还能够侵入并破坏肾集合管的肾乳头细胞和肾小管上皮细胞，形成结晶核心，这种晶体核心作为常见的结石前体，最终诱发结石形成［8，9］。

由此可见，结石病与NB之间的确存在着千丝万缕的联系，围绕二者的研究也在不断开展，然而以往的研究更多关注于纳米细菌对肾小球损害的微观层面。缺乏从析出结晶到聚结为大体结石的宏观动态观测，如此，寻求一种更加直观立体的检测手段，来实时动态监测结石的发生发展过程，亟待完善。

mirco-CT又称微型CT、显微CT，是一种非破坏性的3D成像技术，可以在不破坏样本的情况下清楚了解样本的内部显微结构。它与普通的临床CT相比，前者采用锥形X线束，这不仅能够获得真正各向同性的容积图像，提高空间分辨率（可达微米级别），提高射线利用率，而且在采集相同3D图像时速度远远快于普通CT。mirco-CT的高速发展主要应用于骨组织的三维定量分析［10］，其观察和测量骨组织相对于传统的组织切片技术具有明显的优势［11-13］。同理，结石也具有高密度物理特性，因此在既往研究的基础上，笔者大胆建立纳米细菌Wistar大鼠肾结石模型，利用mirco-CT技术，建设结石模型三维立体影像学资料，动态监测体内肾结石动态发生发展过程，从宏观角度进一步为研究NB形成结石提供更加直观立体的数据支持。同时与病理组织学检查结果进行横向比较，微观与宏观两大层面，双管齐下，为寻求结石形成机制提供新思路。

笔者将mirco-CT结果同HE染色结果进行比较，数据分析得，对照组mirco-CT未检测到高密度影，HE切片亦未检测到病理学改变。纳米细菌组纳米细菌Wistar大鼠肾结石模型mirco-CT自第7～10周，共计检测到高密度影4只，HE切片染色技术显示，第4周及第6～10周，共计11只晶体阳性标本。采用筛检试验的评价这一 “金标准”，对mirco-CT与病理组织学检验两种技术进行综合评价，就其灵敏度、特异度、假阴性率、假阳性率及其Kappa值进行计算，得出Kappa值≈0.4199，一致性较差。探究其中原因，总结如下：HE染色病理切片的观察，是在微观层面上，就肾病理学改变进行检测，得出的数据反应肾小管上皮细胞的病理损伤程度，而mirco-CT是在宏观角度，从结晶积累形成结石后，动态记录结石的发生发展过程，由于NB在造模过程中，因其自身因素（纳米细菌生长缓慢，新陈代谢率为普通细菌的万分之一）导致结石形成缓慢，部分标本未检测到，可能是造模周期不足所致［14］，另外，结石的发生发展是一个动态过程，前期结晶数量少，尚未形成大的片状或团状，难以检测到结石高密度影，从而出现假阴性的可能。对于mirco-CT技术，笔者经验尚且不足，参数设置等需要进一步调整。

HE染色切片在微观角度更能揭示纳米细菌对肾小管上皮的损伤程度，mirco-CT在另一个层面，构建了一个三维立体模型，在不破坏大体标本的情况下，探究其内在微观结构，更加的直观与立体，可以为结石疾病的发生机制提供更为翔实的物理数据，二者相辅相成，共同探讨纳米细菌在肾结石形成中的作用，其效果更加优越。纳米细菌为结石病病因学的发展提供了新方向，先进的科学技术诸如mirco-CT及病理组织切片技术等，为“新方向”保驾护航，但究其内在机制，仍然不甚明了，期待进一步研究。

［1］ RULE AD，BERGSTRALH EJ，LI X，et al.Kidney stones and the risk for chronic kidney disease［J］.Clin Am Soc Nephrol，2009，4（4）：804-811.

［2］ SOMMER AP，ORON U，PRETORIUS AM，et al.A preliminary investigation into light-modulated replication of nanobacteria and heart disease［J］.Clin Laser Med Surg，2003，21（4）：231-235.

［3］ CICFTIOGLU N，KURONEN L，AKERMAN K，et al.A new potential htreat in antigen and antibody products：Nanobacteria.Vaccines97［M］.Brown F，Burton D，Dohertyt P，Mekalanos，and Norrby E.Cold Spring Harbor Laboratory press，Cold Spring Harbor，1997：99-103.

［4］ KAJANDER EO，CIFTCIOGLU N.Nano bacteria as extremophiles［J］.Proc SPIE Int，1999，3755（1）：106-112.

［5］ KAJANDER E O，CIFTCIOGLU N.Nanobacteria：an alternative mechanism for pathogenic intra-and extracellular calcification and stone formation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（14）：8274-8279.

［6］胡卫国，王晓峰，徐涛，等.纳米细菌大鼠肾结石模型初步建立及成石因素分析［J］．北京大学学报（医学版），2010，42（4）：433-435.DOI：10.3969/j.issn.1671-167X.2010.04.016.

［7］粟宏伟，王杰，朱永生，等.钙化性纳米微粒致大鼠肾结石模型的构建［J］．重庆医学，2016，45（3）：310-312，316.DOI：10.3969/j.issn.1671－8348.2016.03.007.

［8］ KHULLAR M，SHARMA SK，SINGH SK，et al.Morphological and immunological characteristics of nanobacteria from human renal stones of a north Indian population［J］.Urol Res，2004，32（3）：190-195.

［9］ SHIEKH FA，MILLER VM，LIESKE JC.Do calcifying nanoparticles promote nephrolithiasis?A review of the evidence［J］.Clinical Nephrology，2009，71（1）：1.

［10］姜玲，金东春，黎卫星，等.显微CT在口腔种植研究领域中的应用［J］．中华临床医师杂志（电子版），2009，3（11）：71-74.

［11］吴兴，汤光宇.骨质疏松骨髓微环境的影像研究进展［J］.国际医学放射学杂志，2016，39（4）：390－394.DOI：10.19300/j.2016.Z3898.

［12］ RITMAN EL.Micro-computed tomography-current status and developments［J］．Annu Rev Biomedl Eng，2004，6（1）：185-208.

［13］ SNOEKS TJ，KAIJZEL EL，QUE I，et al.Normalized volume of interest selection and measurement of bone volume in micro CT scans［J］．Bone，2011，49（6）：1264－1269.DOI：10.1016/j.bone.2011.09.037.

［14］ DE OLIVEIRA R C，LELES C R，NORMANHA L M，et al.Assessments of trabecular bone density at implant sites on CT images［J］.Oral Surgery Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2008，105（2）：231-238.

［2017－11－17 收稿，2017－12－12 修回］