遗传性对称性色素异常症一家系ADAR基因检测

杨建强 罗浩杰 连炜炜 沈云佳

遗传性对称性色素异常症(Dyschromatosis Symmetrica Hereditiaria，DSH，OMIM：127400)，是一种少见的高外显率常染色体显性遗传病[1]。DSH临床表现为手足背对称性色素减退及色素沉着斑，部分患者颜面部位可见雀斑样改变[2]。2003年，Zhang等[3]将本病致病基因定位在1q11-1q21区域，随后日本学者Miyamura等[4]将致病基因确定为编码双链RNA特异性腺苷脱氨酶基因(adenosine deaminase，RNA specific，ADAR基因，又称为DSRAD基因)。本研究通过对一个临床诊断DSH家系的ADAR基因进行突变检测，明确了DSH诊断，并为该家系的遗传咨询提供依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究家系来源于浙江。先证者，女，28岁。因自幼面部和手足部色素沉着斑，就诊于我院皮肤科。患者5～6岁开始面额部出现散在斑点状色素沉着斑，呈褐色，继而在双手足背出现散在米粒大色素沉着和减退斑。皮损夏季较明显，冬季颜色稍淡，但始终不消退。否认近亲结婚史及其他系统性疾病史。系统检查均未见异常。皮肤专科检查：面部可见较散在雀斑样色素沉着，双手背、足背远端及多趾背可见散在分布的色素减退斑，伴有褐色色素沉着斑。其临床表现符合DSH，但皮损范围局限且不甚明显(图1)。本研究家系共4代(图2)，其中患者3例。家系中所有患者口唇、口腔黏膜、指(趾)甲、牙齿均正常，生长发育良好。收集患者及健康家属成员血样共9份。结合家系遗传史、典型的临床表现初诊为遗传性对称性色素异常症。该女性先证者不愿作组织病理检查。

1.2 方法

1.2.1 标本收集和DNA提取 向患者及其亲属说明研究目的和意义后，所有提供血样的家系成员和100名无血缘关系健康对照人群。将采集外周全血3 mL，置2% EDTA抗凝剂的试管中，-80℃保存。从低温冰箱取出外周血样，完全融化后用Takara DNA提取试剂盒提取外周血基因组DNA。

图1 先证者双手背及手指背侧可见散在褐色色素沉着斑和色素减退斑

家系共4代，其中3例患者，6名正常个体。■男性患者，●女性患者，↑先证者

图2 家系图

1.2.2 引物设计与合成 根据GENEBANK中公布的人类ADAR基因的cDNA序列。为扩增该基因全长采用Primer5.0软件设计12对PCR特异性扩增引物。其所扩增的序列涵盖了ADAR基因的全部15个外显子的编码区域及内含子连接区域序列。引物由上海华大基因科技有限公司合成。其中2号外显子的引物序列(表1)。

表1 用于扩增2号外显子的引物序列

1.2.3 基因扩增、测序和序列比对 把提取的基因组DNA标化定量，并进行PCR扩增。PCR反应在Biometra PCR仪上进行，PCR反应体系(25 μL)，其中包括：10 x buffer(含Mgcl2)2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.5 U，l0 mmol/L双向混合引物0.5 μL，标化DNA模板1 μL，加灭菌双蒸水至25 μL。反应条件为：预变性95℃ 5 min，35个循环包括：变性94℃ 40 s、退火58℃ 60 s、延伸72℃ 55 s，最后延伸72℃ 10 min。根据PCR产物片段长度，采用1.5%～2%琼脂糖凝胶电泳检测后，将PCR扩增的产物片段经割胶回收特异性目的条带，方法参照QIAgen纯化回收试剂盒说明书，回收胶块中的PCR产物片断[5]，送上海华大基因有限公司进行双向反应测序，将测序结果所得序列与Genbank中人类ADAR基因的标准序列比对。

2 结果

通过12对引物进行PCR扩增，获取患者和正常人的ADAR基因组中特异性片段。对患者各个PCR产物进行纯化、直接双向测序，发现第2号外显子第982位碱基呈双峰改变(c.982C>T，p.R328X)，但在家系中健康个体和无血缘关系的正常人中无相应突变。该突变(c.982C>T，p.R328X)，可致使mRNA提早出现终止密码，最终导致氨基酸的翻译出现提前终止和蛋白质的截短。先证者儿子年幼(3岁)，其母曾担心其是否具有该遗传性疾病，但经检测未发现该突变(图3)。

3a：患者序列中可见c.982C>T突变；3b：健康个体中并未发现该突变

图3 家系中患者和正常个体ADAR基因2号外显子测序片段比对

3 讨论

DSH亦称Dohi(网状)肢端色素沉着，是较少见的一种外显率较高的常染色体显性遗传性皮肤病。DSH在日本人群和中国人群中相对报道较多[6]。该病主要累及暴露部位皮肤，尤其是手足背部位，部分患者可伴发面部、颈部和前上胸部雀斑，因而影响美观，常给患者带来较大的心理负担。该病组织病理可见：色素沉着斑处表皮棘层下部和基底层内黑素增加，真皮上部嗜黑素细胞增多及少量淋巴细胞浸润，而色素减退斑处基底层色素减少乃至消失[6]。

自从2003年发现该病的致病基因以来，针对该病的基因诊断的报道逐渐增加。该病的致病基因--ADAR基因，又称为DSRAD基因(double-stranded RNA-specific adenosine deaminase)，全长约40 kb，包括15个外显子，编码了含有1226个氨基酸序列的蛋白质，其中2号外显子、2～7号外显子和9～14号外显子分别编码了ADAR蛋白分子中的2个Z-DNA结合区域(Z-α和Z-β)、3个双链RNA结合区域(dsRNA 结合区域，DSRM)和1个脱氨酶(ADEAMc)区域，构成了一个完整的双链RNA特异性腺苷脱氨酶[7,8]。

本研究家系具有典型的临床表现和常染色体显性遗传特征，临床诊断为DSH。DSH的发病常在幼年起病，逐渐出现面部雀斑样改变和手足背部色素沉着斑和减退斑，本研究中先证者儿子尚年幼，暂无明显色素异常。但先证者希望能进一步开展基因诊断并了解其儿子是否遗传该病。

本实验研究采用对ADAR基因进行了外显子的PCR扩增并直接测序，发现该家系中所有患者存在第982位碱基发生无义突变(c.982C>T)，这导致mRNA在第328位氨基酸提早出现终止密码(p.R328X)，进而可能导致该蛋白分子Z-alpha区域的缺陷。该家系正常成员和100名无血缘关系的正常对照均不存在此改变。本研究发现的c.982C>T突变，也曾为Hou等[9]所报道，说明该突变有可能是存在于浙皖地区汉族人DSH患者中ADAR基因的突变热点，有待于今后对DSH患者人群的进一步研究。

截止2017年2月，人类遗传基因数据库(The Human Gene Mutation Database，HGMD，http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=ADAR)报道了155个位点突变或突变类型，其中包括了10个导致Aicardi-Goutières syndrome的突变。Aicardi-Goutières syndrome(Aicardi-Goutières 综合征，AGS)是一种罕见的幼年自体免疫疾病，可表现为后天性小头畸形、基底节区钙化、脑白质营养不良、脑萎缩、脑脊液慢性淋巴细胞及α-干扰素增多为特征的遗传性脑病，与ADAR等数个基因变异有关[10]。但是本研究中家系均未出现任何免疫和神经发育不良的特征，不支持该病诊断。

本研究通过ADAR基因突变筛查，明确了该病的诊断，且通过对家族中幼儿的基因检测，排除了c.982C>T突变，提示该成员为健康个体。为向该家系开展遗传咨询提供依据。

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[9] Hou Y, Chen J, Gao M, et al.Five novel mutations of RNA-specific adenosine deaminase gene with dyschromatosis symmetrica hereditaria[J].Acta Derm Venereol,2007，87(1):18-21.

[10] Rice GI, Kasher PR, Forte GM, et al.Mutations in ADAR1 cause Aicardi-Goutieres syndrome associated with a type I interferon signature[J].Nat Genet,2012，44(11):1243-1248.