龙胆泻肝汤对人角质形成细胞株HaCaT细胞增殖的影响

孙淑娜 张小平 魏海峰 周曙杰 梁晨希 吴国境 韩 旭 张晓杰

龙胆泻肝汤是临床治疗银屑病的传统经方[1]，但目前对其在治疗中的分子机制了解甚少。银屑病皮损处病理特征之一包括表皮角质形成细胞异常增生[2]。本研究将利用人表皮细胞HaCaT作为研究模型，探讨龙胆泻肝汤对HaCaT细胞增殖的影响并分析其作用机制，为进一步揭示龙胆泻肝汤的作用机制以及开发治疗银屑病的新靶点奠定理论基础和提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 永生化人表皮形成细胞株HaCaT细胞购于武汉大学中国典型培养物保藏中心。

1.1.2 主要试剂 胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培养基：美国Gibco公司；DAPI、BrdU、MTT和PI：Sigma公司。抗BrdU一抗：Sigma公司；Western blot用一抗和siRNAs：Santa cruz公司；DAPI，RIPA裂解液。Trizol，Lipofectamine 2000：美国Thermo公司。TRITC(罗丹明) 与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗：中衫金桥公司。RNaseA和Light Cycler 480 SYBR Green I Master：ROCHE公司。cNDA逆转录试剂盒：天根生化科技有限公司。PCR引物：上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 主要方法

1.2.1 胆泻肝汤药液制备 龙胆草6 g，黄芩9 g，山栀9 g，泽泻12 g，车前子9 g，生地黄20 g，当归8 g，柴胡10 g，甘草6 g。将上述中药浓缩成1 mL相当于1.5 g原中药材的药液，过滤除菌，4℃冰箱保存备用。细胞培养时稀释到相应终浓度。

1.2.2 细胞培养 使用含有10%胎牛血清的DMEM培养液中贴壁培养HaCaT细胞株，隔天换液。取状态较好的对数生长期HaCaT细胞进行实验。龙胆泻肝汤药物处理组使用含有终浓度20～100 μg/mL药液的DMEM培养基。

1.2.3 流式细胞术检测细胞周期 使用0.1%胰酶消化收集细胞，使用75%乙醇-20℃固定过夜。待检测时使用PBS洗涤细胞后，加入PI和RNaseA至终浓度50 μg/mL，避光静置30 min。流式细胞仪记录激发波长488 nm处的红色荧光，收集数据。实验重复三次。

1.2.4 MTT法检测细胞增殖 将HaCaT细胞株接种至96孔细胞培养板，收集细胞前使用含MTT 1 mg/mL的培养基37℃继续培养细胞4 h。弃上清后加入二甲基亚砜(DMSO)震荡混匀，37℃避光放置20 min。用酶标仪在490 nm波长状态下测其吸光度值。实验每组设6个重复孔，实验重复三次。

1.2.5 Western blot 待收集细胞使用RIPA裂解液裂解提取蛋白，使用BCA法蛋白定量，取40 μg变性后样品进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉TBS封闭，4℃一抗孵育过夜，37℃二抗孵育1 h，洗膜，ECL化学发光，胶片曝光，显影定影。所有实验重复三次。

1.2.6 BrdU掺入检测 使用含50 μM BrdU的培养基培养细胞20 min，PBS洗涤后，使用免疫染色固定液固定，加入2N盐酸37℃变性30 min，0.1 M硼酸钠中和2次，含Triton-X 100 0.5%的PBS处理15 min，5% BSA室温封闭1 h，BrdU一抗4℃孵育过夜，加入TRITC二抗37℃ 处理1 h，DPAI染核，荧光显微镜观察。每组细胞随机选择3个视野，在高倍镜(×200)计数每个视野100个HaCaT细胞中BrdU阳性细胞的比例，取3个视野的平均百分数为判定结果，实验重复三次。

1.2.7 Realtime PCR 将药物处理的HaCaT细胞使用Trizol法裂解提取并参照说明书提取RNA和逆转录。Realtime PCR检测：每个样品设4个复孔，每复孔10 μL反应体系，具体包括Light Cycler 480 SYBR Green I Master 5 μL、去离子水4.2 μL、cDNA 0.5 μL、引物0.3 μL，反应条件：预变性94℃ 3 min，95℃变性30 s，退火60℃ 30 s，延伸72度30 s，共40个循环。以GAPDH为内参。实验重复三次。引物序列qGAPDH-F：5'- CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT-3'，qGAPDH-R：5' GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT -3'；qCDK4-F：5′-ATGGCTACCTCTCGATATGAGC-3′, q CDK4-R：5′- CATTGGGGACTCTCACACTCT-3′；qCyclin D1-F：5′- GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′, qCyclin D1-R：5′- CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′。

1.2.8 Lipofectamine 2000转染siRNA 将细胞接种到6孔板，24 h后，参照说明，分别加入适量的转染试剂lipofectamin 2000和siRNA，混匀，室温放置10 min。将配制好的转染复合物加入到6孔板中siRNA终浓度为50 nM。

1.2.9 统计学方法 所有数据均用SPSS 12.0 软件进行分析处理，采用单因素方差分析，组间数据应用t检验分析评价。

2 结果

2.1 龙胆泻肝汤抑制HaCaT细胞的增殖 利用MTT检测细胞增殖，实验重复三次，结果一致，所示的有代表性的结果如图1显示，龙胆泻肝汤处理72 h后，与对照组(未使用药物处理组)相比，细胞增殖明显受到抑制，并且龙胆泻肝汤对HaCaT细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性增加。100 μg/mL的龙胆泻肝汤处理的细胞，其OD值仅为对照细胞的17.4%。因此，该结果表明龙胆泻肝汤能够有效抑制银屑病表皮细胞的增殖。

图1 龙胆泻肝汤抑制HaCaT细胞增殖。使用含0～100 μg/mL龙胆泻肝汤药液的DMEM培养基37℃培养细胞72 h，收取细胞进行MTT检测

2.2 龙胆泻肝汤诱导HaCaT细胞停滞在G0/G1期 为明确龙胆泻肝汤抑制HaCaT细胞增殖的机制，我们使用流式细胞术分析了龙胆泻肝汤对HaCaT细胞周期的影响。实验重复三次，结果一致，所示的有代表性的结果(图2)，未处理的细胞各周期比例为：G1期细胞比例为51.98%，S期细胞比例为40.74%，G2/M期为7.28%。与对照细胞相比，使用100 μg/mL龙胆泻肝汤处理细胞48 h后，细胞G1期比例上升至79.36%，S期细胞下降到17.03%，G2/M期下降到3.61%；相比对照细胞，龙胆泻肝汤处理组细胞G1期比例明显增加，上调了约28%，S期则下降了约23%。

图2 龙胆泻肝汤处理导致HaCaT细胞G1期比例上调。药物处理组细胞使用含100 μg/mL龙胆泻肝汤药液的DMEM培养基37℃培养，对照组使用含等体积去离子水的DMEM培养基培养相同时间。培养48 h后收取细胞进行细胞周期检测。药物组，100 μg/mL龙胆泻肝汤药液的DMEM；对照组， 含与药物组龙胆泻肝汤等体积去离子水的DMEM培养基

2.3 龙胆泻肝汤抑制HaCaT细胞的DNA复制 随后，我们进行了BrdU掺入检测以分析龙胆泻肝汤对HaCaT细胞DNA复制的影响。实验重复三次，结果一致，所示的有代表性的结果(图3)，对照细胞组BrdU掺入阳性细胞比列约为(68.4±7.2)%， 100 μg/mL龙胆泻肝汤处理细胞48 h后，BrdU掺入阳性细胞比例降低至(11.3±2.6)%，而两者相比有显著性差异。该结果表明龙胆泻肝汤能够有效抑制HaCaT细胞DNA复制。

图3 龙胆泻肝汤处理抑制HaCaT细胞DNA复制。药物处理组细胞使用含龙胆泻肝汤100 μg/mL药液的DMEM培养基37℃培养，对照组使用含与龙胆泻肝汤等体积去离子水的DMEM培养基培养相同时间。48 h后收取细胞进行BrdU检测。药物组，100 μg/mL龙胆泻肝汤药液的DMEM；对照组，含与药物组龙胆泻肝汤等体积去离子水的DMEM培养基。

2.4 龙胆泻肝汤抑制HaCaT细胞Rb蛋白磷酸化 Rb蛋白磷酸化可以解除Rb对E2F转录因子的抑制效应，使细胞由G1期进入S期。因此，我们使用Western blot实验分析了龙胆泻肝汤处理后HaCaT细胞Rb蛋白的磷酸化水平。实验重复三次，结果一致，所示的有代表性的结果(图4a)，使用100 μg/mL龙胆泻肝汤处理细胞48 h后，尽管Rb蛋白总量没有明显变化，但Rb的蛋白的磷酸化(p-Rb)表达明显下调。

为了明确Rb在龙胆泻肝汤抑制HaCaT细胞增殖中的作用。我们使用siRNA干扰Rb的表达。Western blot实验结果显示siRNA显著抑制HaCaT细胞内Rb蛋白表达(图4b)。细胞周期分析结果显示， siRNA能够有效抑制龙胆泻肝汤导致的HaCaT细胞G0/G1期阻滞(图4c)。这些结果表明龙胆泻肝汤能够通过抑制Rb的磷酸化，促进其对E2F的抑制作用，导致HaCaT细胞G1期停滞。所有实验重复三次，结果一致。

图4 龙胆泻肝汤处理导致HaCaT细胞p-Rb蛋白表达下调。4a：龙胆泻肝汤处理组和对照组细胞培养48 h后，收取细胞提取总蛋白进行Western blot。4b：转染干扰Rb的siRNA (50 nM)或等量的阴性对照siRNA入HaCaT细胞，转染8 h后换含100 μg/mL清龙胆泻肝汤或对照的DMEM培养基继续培养细胞48 h。4c：细胞转染siRNA并加入龙胆泻肝汤处理48 h后(方法同图4b)。药物组，100 μg/mL龙胆泻肝汤药液的DMEM；对照组， 含与药物组龙胆泻肝汤等体积去离子水的DMEM培养基

2.5 龙胆泻肝汤抑制HaCaT细胞CDK4/Cyclin D1表达 CDK4/Cyclin D在Rb磷酸化中发挥核心的作用。因此，我们分析了CDK4和Cyclin D1的表达。Western blot结果显示龙胆泻肝汤处理细胞内Cyclin D1和CDK4的表达均出现明显下调(图5a)。为了进一步明确龙胆泻肝汤调控CDK4和Cyclin D1表达的分子机制，我们又使用Realtime PCR检测了龙胆泻肝汤处理后HaCaT细胞内两个基因mRNA的含量。结果显示与对照组相比，龙胆泻肝汤药物处理组HaCaT细胞内Cyclin D1 mRNA含量较对照组明显降低(图5b)，而CDK4的mRNA没有明显改变(图5b)。

图5 龙胆泻肝汤处理导致HaCaT细胞CDK4和Cyclin D蛋白表达下调。龙胆泻肝汤处理组和对照组细胞培养48 h后，收取细胞提取总蛋白进行Western blot(5a)和Realtime PCR(5b)。药物组，100 μg/mL龙胆泻肝汤药液的DMEM；对照组， 含与药物组龙胆泻肝汤等体积去离子水的DMEM培养基

3 讨论

银屑病病程长，缠绵难愈，容易复发，大多伴随终生，对患者的身心健康及日常生活都带来极大伤害[3]。银屑病给患者、家庭和整个社会带来巨大的精神和经济负担，是皮肤科领域亟待解决的难题之一。传统的中医运用中医辨证以及其特有的治疗方法，在银屑病治疗上具有改善病情、延长缓解期、副作用小、远期疗效好等特点，彰显出了独特的优势。龙胆泻肝汤始载于《兰室秘藏》一书，是临床中常用方剂，由龙胆草、栀子、黄芩、车前子、泽泻、木通、生地黄、当归、甘草组成，具有泻肝胆实火，清下焦湿热之功效。因木通在现代药理研究中，明确有肾毒性，故后世在使用龙胆泻肝汤治疗疾病时，已经不再使用木通，本次实验也未纳入。在银屑病治疗中，龙胆泻肝汤也表现出较好的疗效[4]，但对其作用的分子机制尚不清楚。

银屑病皮损处特征包括表皮角质形成细胞过度增殖和异常分化，淋巴细胞(绝大多数为T细胞)浸润，以及真皮血管的改变[5]。我们的结果显示龙胆泻肝汤可显著抑制人角质形成细胞HaCaT的增殖，降低DNA复制能力，诱导使其停滞在G0/G1期。角质形成细胞(keratinocyte, KC)是表皮细胞的主要成分，对皮肤正常的结构和功能维持有着重要的作用。KC的异常增殖和分化与多种角化性皮肤病及表皮肿瘤的发生密切相关。与其他炎症性皮肤病相比，银屑病最特征性的病理表现之一是表皮高度增殖(棘层肥厚)，颗粒细胞层缺失，表皮突规则地向下延伸，角质层增厚(角化过度)和不完全的角质形成细胞分化及成熟时间缩短(角化不全)，角质层细胞异常堆积，形成鳞屑[3，6，7]。此外，大量研究也揭示了KC在银屑病发生中的重要作用。鉴于银屑病的临床病理特征和发病特点，抑制KC过度增殖分化也是银屑病治疗的重要途径之一。因此，我们的结果提示抑制细胞DNA复制、抑制细胞增殖是龙胆泻肝汤治疗银屑病的重要机制之一。

E2F1能够转录激活包括Cyclin E在内的多种G1到S期转换调控因子以及DNA复制相关蛋白，促进细胞的增殖。而Rb能够结合E2F1，使后者丧失转录激活功能。因此抑制Rb的功能是使细胞由G1期进入S期，进行细胞增殖的关键[8]。CDK4激酶能够磷酸化Rb蛋白，使其失活，释放E2F1，促进细胞周期的转换和增殖。Cyclin D家族蛋白能够与CDK4结合并激活CDK4的活性[9]。本结果显示，龙胆泻肝汤可显著抑制HaCaT细胞内Rb蛋白的磷酸化水平，而利用siRNA干扰Rb能够部分恢复龙胆泻肝汤对HaCaT细胞DNA复制的功能。进一步分析显示龙胆泻肝汤能够下调HaCaT细胞内CDK4和Cyclin D1的表达。目前研究已经发现CDK4/Cyclin D在角质形成细胞增殖中发挥着关键的调控作用，在银屑病皮损中表达异常[10-12]。因此，我们的结果提示，龙胆泻肝汤通过抑制CDK4/Cyclin D-Rb途径而抑制表皮形成细胞的增殖，该途径是龙胆泻肝汤治疗银屑病的靶点之一。

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