T细胞酶联免疫斑点试验及结核蛋白芯片试验对淋巴结核的诊断价值

　　　　　　　　

结核病为结核分歧杆菌引发的传染病，几乎可累及人体所有器官和组织，淋巴结核约占肺外结核发病率的30%[1]。由于淋巴结核发病较为隐匿，其临床症状表现也并不明显，临床上易造成误诊及漏诊，对患者预后造成影响。因而临床迫切需要一种快速而准确的检测手段，从而为淋巴结核患者制定正确的治疗方案。结核蛋白芯片检测与T细胞酶联免疫斑点试验(T cells enzyme linked immunospot,T-SPOT.TB)做为诊断结核病的有效方法已经广泛应用于临床，对于肺结核病的诊断，这两种方法具有特异性较强、检测快速等优点，但在肺外结核尤其是淋巴结核诊断中目前应用较少[2]。本文对结核蛋白芯片检测、T-SPOT.TB试验在淋巴结核及非结核感染患者诊断中的应用进行研究，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料选取安徽省胸科医院2014年1月至2017年5月收治的患者为研究对象，简单随机抽取淋巴结核患者30例为研究组，同时抽取确诊为非结核感染的患者30例为对照组，淋巴结核诊断以病原学或病理学标准为金标准。研究组：男性8例，女性22例 ，年龄14～75岁，平均(40.96±14.16)岁；对照组：男性11例，女性19例,年龄20～73岁，平均(36.76±12.38)岁。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

入选标准：淋巴结肿大入院，通过病原学或病理学活检确诊为淋巴结核的患者；对照组经过影像学检查、痰菌检查、病原学或病理学活检确诊不患有结核病。排除标准：HIV阳性患者；入院前四周接受过抗结核治疗的患者；患者在入院前及住院期间接受免疫抑制剂治疗；患有其他对试验结果有影响疾病的患者。

1.2研究方法

1.2.1蛋白芯片法南京大渊生物技术工程有限公司提供芯片和试剂，南京大渊生物技术工程有限公司生产PBT-X2型生物识别仪对芯片结果进行分析，操作步骤按说明书严格进行。采集患者静脉血，样品编号在蛋白芯片上标记，将患者血清100 μL滴加入蛋白芯片盒内窗口，按操作步骤顺序滴加反应试剂，在试剂反应结束后半小时内采用PBT-X2型生物识别仪对芯片进行结果分析，PBT-X2型生物识别仪设置参数对阴性和阳性结果进行判别。判别标准：脂阿拉伯甘露聚糖，两种分子量不同的结核分枝杆菌蛋白任一抗体检测阳性即判别结果为阳性。

1.2.2T-SPOT.TB试验英国Oxfordimmunotec 提供T-SPOT.TB检测试剂盒，操作步骤按说明书严格进行。采集患者静脉血，分离PBMCs，加培养液重悬PBMCs并孵育过夜，配制每100 μL含有25万个细胞的标准溶液500 μL，每患者个样本设置4个检测孔：空白对照孔(细胞培养液)、抗原A检测孔、抗原B检测孔、阳性对照孔(植物血凝素)。每孔加入100 μL细胞终溶液，在37℃保持湿润的含有5% CO2的培养箱中孵育16～20 h，洗板，然后在每个反应孔加入50 μL标记抗体工作液，2～8℃孵育1 h，洗板后每个反应孔加入50 μL底物显色溶液室温孵育7min，离子水彻底洗涤培养板终止反应，通过酶联免疫斑点系统采用专门的ELISPOT读板仪斑点数量。结果判断标准：空白对照孔斑点数为0～5个时且(抗原A或抗原B孔的斑点数)减去(空白对照孔斑点数)≥6；空白对照孔斑点数为6～10个时且(抗原A或抗原B孔的斑点数)。

2　结果

2.1两组试验结果比较研究组结核蛋白芯片试验阳性率为60.00%，T-SPOT.TB试验阳性率为90.00%，均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1两组患者试验结果比较[例(%)]

试验研究组(n=30)对照组(n=30)阳性阴性阳性阴性χ2值P值结合蛋白芯片18(60．00)12(40．00)6(20．00)24(80．00)10．0000．003T-SPOT．TB27(90．00)3(10．00)2(6．67)28(93．33)41．7100．000

2.2联合检测结果比较研究组联合检测双阳性率为53.33%，高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组联合检测双阴性率为73.33%,高于研究组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2两组患者联合检测结果比较[例(%)]

结果研究组(n=30)对照组(n=30)χ2值P值双阳性16(53．33)2(6．67)13．4130．000双阴性2(6．67)22(73．33)25．0690．000

2.3特异度、敏感度比较T-SPOT.TB试验敏感度为90.90%，结核蛋白芯片试验敏感度为71.42%，差异有统计学意义(χ2=4.383，P=0.036)。T-SPOT.TB试验特异度为93.75%，结核蛋白芯片试验特异度为83.33%，差异无统计学意义(χ2=0.910，P=0.340)。

3　讨论

结核病目前已成为我国关注的公共卫生和社会问题[3]。淋巴结核系结核杆菌感染人体淋巴系统产生的结核病变，包括体表和深部淋巴结核，淋巴结核常见类型有颈部淋巴结核、纵隔淋巴结结核、腹内淋巴结核等[4]。目前对于淋巴结核尚缺乏有效的诊断手段，对此类疾病的漏诊率、误诊率较高。淋巴结核的诊断多需行手术活检淋巴组织，结合病原学或者病理学才能明确诊断[5]。

目前，临床检测患者血清中是否存在结核分枝杆菌可采用结核蛋白芯片、T-SPOT.TB 试验等方法[6]。结核蛋白芯片克服了结核分枝杆菌感染人体后，免疫背景及病程造成的抗原表达数量、种类不同导致的检测特异性降低[7]。人体受结核分枝杆菌感染后T细胞受刺激而活化，T-SPOT.TB做为一种体外诊断能够检测活化的效应T细胞，从而诊断结核感染[8]。T-SPOT.TB对具有结核潜伏感染风险或疑似结核病的患者均适用，同时该方法能够减少其他分枝杆菌、卡介苗接种引起的假阳性结果[9]。本研究结果表明，T-SPOT.TB试验敏感度较高，特异度较强。

针对淋巴结核目前尚缺乏简便、灵敏的诊断方法，结核蛋白芯片虽然可以辅助诊断结核，但其对淋巴结核阳性率较低[10]。T-SPOT.TB检测方法已成为临床诊断结核病较为敏感的检测方法[11]。本研究发现2例假阴性患者，可能与患者受结核感染阶段不同，静脉血液采集在患者细胞免疫发生之前，患者存在肿瘤、免疫功能低下、口服免疫抑制剂等问题相关[12]。T-SPOT.TB结果仅提示患者体内存在针对结核分枝杆菌的特异效应T细胞，不能确定其结核是否处于活动期。如果将结核蛋白芯片检测与T-SPOT.TB联合检测，相互印证可能更有利于淋巴于结核的诊断。本研究显示研究组联合检测双阳性率高于对照组，对照组联合检测双阴性率高于研究组，差异有统计学意义(P<0.05)，T-SPOT.TB敏感度高于结核蛋白芯片试验敏感度，差异有统计学意义(P<0.05)，结核蛋白芯片联合T-SPOT.TB检测可以辅助诊断淋巴结核。

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