儿童肺泡灌洗液RT-PCR检测对支原体感染的辅助诊断价值探讨

　　　　　

肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae,MP)作为寄居在呼吸道中的条件致病菌，是介于细菌和病毒间的一种病原微生物，也是引起儿童非典型性感染的主要病原体[1]。儿童感染后导致的支原体肺炎，病程长，症状重[2]，且体征、影像学检查缺乏特异性，因此，MP的病原学检查对早期诊断和及时治疗尤为重要。MP感染一般为自限性，但合并症的发生，可威胁患儿生命[3]。通过测定肺泡灌洗液中MP-DNA，可提高MP的检出率[4]。由于MP的潜伏期至少为1周[5]，因此将患儿发病到入院前的时间作为入院前病程，分为入院前病程≤7 d和>7 d，通过实时荧光定量PCR对肺泡灌洗液MP-DNA的定量检测，并结合间接荧光免疫法对静脉血MP-IgM的定性检测，探讨实时荧光定量PCR对MP感染的辅助诊断价值，以期为临床诊治提供参考。

1　资料与方法

1.1一般资料选取安徽省儿童医院2016年1月至12月收治的235例肺炎患儿为研究对象，MP-DNA阳性和/或MP-IgM阳性。患儿中，男患儿138例，女患儿97例；年龄1～14岁；重症肺炎91例中，包括难治性支原体肺炎3例，大叶性肺炎25例，其余63例肺炎合并胸腔积液、肺脓肿、肝功能损害、肺不张等。重症性肺炎的诊断标准符合《诸福棠实用儿科学》[6]，分为重症肺炎(91例)与轻症肺炎(144例)。1～3岁为幼儿期，>3～14岁为学龄前期和学龄期[7]，据此将患儿分为1～3岁(80例)、>3～14岁(155例)。

1.2研究方法

1.2.1仪器与试剂美国ABI公司7300实时荧光定量PCR仪、美国奥林巴斯公司荧光显微镜，试剂盒为湖南圣湘公司MP荧光定量检测试剂盒、西班牙VIRCELL公司PENUMOSLIDE-IgM呼吸道九联检测试剂盒。

1.2.2实验方法

1.2.2.1MP-DNA检测通过实时荧光定量PCR技术检测MP-DNA。收集患儿支气管肺泡灌洗液，取1 mL混匀后的支气管肺泡灌洗液加入1.5 mL Ep管中，将配置好的反应体系加入PCR仪反应，根据标准曲线得到拷贝数。按照试剂盒操作说明，MP-DNA拷贝量<4.00×102copies/mL为阴性，MP-DNA拷贝量≥4.00×102copies/mL为阳性；同时根据本实验室前期积累数据，经数据统计MP-DNA拷贝量中位数在1.00×105copies/mL，分为低拷贝组(4.00×102～1.00×105copies/mL)、高拷贝组(拷贝量>1.00×105copies/mL)。

1.2.2.2MP-IgM 检测通过间接荧光免疫法检测MP-IgM。采集患儿静脉血2 mL，离心取上清，按照试剂盒操作说明,将最后形成抗原抗体复合物IgM-FITC在荧光显微镜下观察结果，并根据试剂盒阳性标准判断检测结果。

1.3统计学方法应用SPSS 21.0进行统计分析，计量资料以中位数及四分位数[P50(P25, P75)]表示，组间比较采用非参数Mann-Whitney U检验,计数资料以率描述，率的比较采用χ2检验， 以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1不同性别MP-DNA及MP-IgM阳性率比较男患儿MP-DNA阳性率为93.48%，女患儿阳性率为92.78%，差异无统计学意义(P>0.05)。男患儿MP-IgM阳性率为37.68%，低于女患儿，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1不同性别患儿MP-DNA及MP-IgM检测结果比较[例(%)]

性别例数MP⁃DNA(+)MP⁃IgM(+)男138129(93．48)52(37．68)女9790(92．78)52(53．61)χ2值0．0435．857P值0．8350．016

2.2不同年龄MP-DNA及MP-IgM阳性率比较1～3岁患儿MP-DNA阳性率为87.50%，低于>3～14岁患儿，差异有统计学意义(P<0.05)；不同年龄患儿的MP-IgM阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2不同年龄患儿MP-DNA及MP-IgM检测结果比较[例(%)]

年龄例数MP⁃DNA(+)MP⁃IgM(+)1～3岁8070(87．50)29(36．25)>3～14岁155149(96．13))75(48．39)χ2值6．1923．151P值0．0130．076

2.3不同病程MP-DNA、MP-IgM阳性率比较入院前病程≤7 d患儿MP-DNA阳性率为95.73%，入院前病程>7 d患儿 MP-DNA阳性率为90.68%，差异无统计学意义(P>0.05)； 入院前病程≤7 d患儿MP-IgM的阳性率为34.19%，低于入院前病程>7 d患儿，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3不同病程患儿MP-DNA及MP-IgM检测结果比较[例(%)]

入院前病程例数MP⁃DNA(+)MP⁃IgM(+)≤7d117112(95．73)40(34．19)>7d118107(90．68)64(54．24)χ2值2．3609．573P值0．1240．002

2.4MP-DNA阳性率和拷贝量与病情的关系重症肺炎患儿MP-DNA阳性率为95.60%，轻症肺炎患儿MP-DNA阳性率为91.67%，差异无统计学意义(P>0.05)；重症肺炎中MP-DNA高拷贝量占85.71%，轻症肺炎中MP-DNA高拷贝量占65.28%，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。重症肺炎患儿MP-DNA的拷贝量为9.34×106(1.80×106，1.06×108)copies/mL，轻症肺炎患儿MP-DNA的拷贝量为2.9×106(4.96×104，3.00×107)copies/mL，差异有统计学意义(Z=-3.156，P=0.002)。

表5不同病情患儿MP-DNA阳性率及拷贝量检测结果比较[例(%)]

肺炎例数MP⁃DNA(+)MP⁃DNA高拷贝量重症肺炎9187(95．60)78(85．71)轻症肺炎144132(91．67)94(65．28)χ2值1．36311．869P值0．2430．001

3　讨论

MP是儿童呼吸道感染的主要病原体，可发生在任何季节[5]，感染后临床表现不典型，若不及时治疗，病情迁延，会增加治疗难度[8]；且感染患儿的年龄越小，越容易出现呼吸困难[9]。目前，培养法仍是诊断MP感染的金标准，但耗时长。RT-PCR可对MP核酸水平进行定量检测，与培养法及Elisa、间接免疫荧光法比较，干扰因素少，结果可量化，精准度更高，已越来越多应用于MP的检测中。

本研究结果显示，女患儿血清MP-IgM阳性率高于男患儿，和何雯等[10]报道一致。与赵岩等[11]研究结果不同的是，本研究中男女患儿MP-DNA的阳性率无明显差异，这可能与样本来源、种类不同有关。本研究>3～14岁患儿MP-DNA阳性率要高于1～3岁患儿，与相关研究[11]结果一致，考虑为>3～14岁患儿多处在幼儿园、学校等人群密集场所[5]，易出现交叉感染，从而造成MP在该年龄段的高检出率。

本研究还对发病到入院前不同病程的患儿MP-DNA、MP-IgM阳性率进行了分析，结果显示入院前病程≤7 d与入院前病程>7 d患儿的MP-DNA阳性率无明显差异，与卢志威等[12]报道相似。而入院前病程>7 d患儿的MP-IgM阳性率却高于≤7 d患儿，可能和MP的潜伏期以及感染后相关抗体出现的时间有关。一般MP的潜伏期至少为1周[5]，MP-IgM也在感染后1周左右可检测到，3～4周达高峰，2～4个月消失。因此，在入院前病程>7 d的患儿中，更易检出MP-IgM。

此外，本研究未发现重症肺炎和轻症肺炎患儿MP-DNA的阳性率的明显差异，一定程度上表明MP-DNA检出率受病情的影响较小。同时结果显示重症肺炎患儿的MP-DNA的拷贝量要高于轻症肺炎，这与患儿局部组织高菌量的定植，引发了强烈的免疫炎性反应有关，提示MP-DNA拷贝量的高低和病情的轻重有一定的关系。郭飞波等[13]研究发现，重型支原体肺炎患儿体内促炎因子(IL-8、TNF-α)高于轻型患儿，佐证了MP的发病机制依赖于感染后引发的免疫反应。

综上所述，RT-PCR定量检测MP-DNA与间接免疫荧光法定性检测MP-IgM抗体相结合，可提高诊断MP感染的灵敏度，而肺泡灌洗液RT-PCR直接取材于病灶，其拷贝量反应了患儿体内MP复制情况，使患儿病情评估得到了量化，有助于临床开展个体化诊疗。

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