新城疫病毒致鸡胚成纤维细胞病变特性研究

张桂枝 ， 靳双星

(河南牧业经济学院动物科技学院 ， 河南 郑州 450046)

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起家禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病，具有很高的发病率和死亡率，是危害养禽生产的一种重要传染病，OIE将其列为A类疫病。新城疫病毒具有血凝素、神经氨酸酶和溶血素。近年来研究发现NDV感染后，可导致组织损伤、细胞病变、细胞融合、诱导宿主细胞凋亡等[1-2]。鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast，CEF)被广泛应用于细胞和分子生物学等许多方面的研究。

近年来研究发现，NDV存在很多变异株，不同毒株毒力差异较大，强毒株可在体外多种细胞中增殖，通过膜融合而感染宿主细胞[3]，而弱毒株只有在含有胰蛋白酶的细胞中才能增殖[4]。本研究通过新城疫Ⅰ系毒株和新城疫Ⅳ系毒株在CEF上增殖，以观察病毒感染所致的细胞病变(CPE)和致病性的差异，旨在评价NDV对CEF的易感性，为NDV的分离鉴定、增殖及中药提取物体外抗病毒效果研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 供试鸡胚9～11日龄SPF鸡胚由河南后羿生物工程有限公司提供。新城疫Ⅰ系疫苗、新城疫Ⅳ系疫苗由河南牧业经济学院动物医学院微生物实验室提供。经SPF鸡胚绒毛尿囊腔接种复壮，48 h收集病毒液，测定新城疫Ⅰ系毒株、新城疫Ⅳ系毒株的血凝(HA)效价分别为28和27，-20 ℃保存备用。主要仪器设备:细胞培养板为Costar公司产品；二氧化碳培养箱(Thermo公司)；倒置显微镜(Olympus公司)等。主要试剂:DMEM培养液(GIBCO)、新生牛血清(GIBCO)、胰蛋白酶(Invitrogen)等。

1.2 方法

1.2.1 鸡胚成纤维细胞单层制备 无菌取出9～11日龄鸡胚，剪去胚头、爪、翅和内脏，用含有双抗(青霉素100 IU/mL、链霉素100 μg/mL)Hank's液反复冲洗2～3次，剪成1 mm3大小碎块，用0.25%胰蛋白酶消化组织块20 min，然后倾去上层胰酶并用Hank's液洗涤2～3次，用含5%新生牛血清DMEM培养液终止消化，8层无菌纱布过滤，制成1×106/mL的CEF细胞悬液，加至96孔细胞培养板中，0.2 mL/孔，37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养至细胞长成单层，备用[5]。

1.2.2 鸡胚成纤维细胞接种病毒及细胞形态观察 CEF形成单层后，吸出培养液，用Hank's液反复冲洗2～3次，添加用维持液(含1%新生牛血清的DMEM培养液)稀释的稀释度分别为10-1～10-11病毒液0.1 mL/孔；设为4个试验组，分别为新城疫Ⅳ系毒株组、新城疫Ⅰ系毒株组、新城疫Ⅳ系毒株胰酶组和新城疫Ⅰ系毒株胰酶组(胰蛋白酶含量均为25 μg/mL)，另设正常细胞对照(维持液0.2 mL/孔)。试验组在37 ℃、CO2培养箱中吸附1 h，弃去病毒液，加入维持液0.2 mL/孔，继续在37 ℃、 CO2培养箱中培养，分别于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h在倒置显微镜下观察细胞与细胞形态变化，并拍照。

1.2.3 CEF培养上清液HA效价及病毒感染力测定 在细胞培养120 h后测定培养液中病毒血凝效价。按 Reed-Muench 公式计算半数细胞培养物感染量(TCID50)。

2 结果与分析

2.1 NDV致鸡胚成纤维细胞病变观察 由表1和图1(见中插彩版)可知，经鸡胚复壮的新城疫Ⅰ系毒株组和新城疫Ⅰ系毒株胰酶组以不同稀释度接种细胞，均能在鸡胚成纤维细胞上增殖，24 h后产生细胞病变，48 h产生典型的CPE，最初表现为细胞肿大，回缩变圆，折光性增强，形成较小的合胞体，细胞之间的空隙变大，但此时细胞单层结构基本完整；72 h发生细胞融合和形成多核巨细胞，残留细胞呈拉网状，折光性进一步增强，细胞变暗；96～120 h单层呈片状脱落，漂浮于细胞培养液中。新城疫Ⅳ系毒株组，整个观察期间未见典型的细胞病变，不产生CPE，细胞单层完整。而新城疫Ⅳ系毒株胰酶组，48 h后产生CPE，早期细胞肿大、变圆、回缩、边界模糊；72 h后细胞病变逐渐明显，胞浆内可见大小不等的空泡或颗粒，没有典型的细胞融合或形成合胞体现象；96 h细胞单层基本完整，120 h细胞单层部分脱壁。

2.2 CEF培养上清液HA效价及病毒感染力测定 由表2可知，不同稀释度的新城疫Ⅳ系毒株组在不含胰酶的CEF上不产生CPE，CEF培养上清液也测不到HA效价；新城疫Ⅳ系毒株胰酶组CEF培养上清液最高HA效价为27；新城疫Ⅰ系毒株组、新城疫Ⅰ系毒株胰酶组CEF培养上清液最高HA效价高于新城疫Ⅳ系毒株胰酶组2个滴度，TCID50也明显增高，证明新城疫Ⅰ系毒株在CEF细胞上的感染力强。

表1 不同处理方式对CEF 病变率的影响

表2 不同处理方式对CEF增殖的病毒HA效价、TCID50的影响

3 讨论

细胞融合是副黏病毒感染细胞的一个重要生物学标志，也是病毒复制、致病作用的一个重要过程和手段[6]。在病毒复制过程中，融合蛋白前体F0裂解为F1和F2才能形成有感染性的子代病毒粒子，这一裂解过程是决定不同毒株毒力强弱的关键[7]。新城疫Ⅰ系毒株为中等毒力，不需要胰蛋白酶催化即能感染鸡胚成纤维细胞，引起典型的CPE，这与NDV F蛋白的裂解位点密切相关，F蛋白裂解位点存在多个碱性氨基酸，有毒力NDV F蛋白的C端含有一对碱性氨基酸，能被宿主细胞内的多种蛋白酶识别和裂解，无需外源蛋白酶[7]。而新城疫Ⅳ系毒株需要胰蛋白酶协助才能在鸡胚成纤维细胞中增殖，胰蛋白酶可以裂解所有的NDV的F0蛋白，体外处理无感染性的病毒可使其恢复感染性，新城疫Ⅳ系为低毒力毒株，只有在添加胰蛋白酶的情况下才能有效增殖[5]。胰蛋白酶可以识别新城疫Ⅳ系弱毒株的单个碱性氨基酸使F0裂解，另外胰蛋白酶也可松散细胞间的紧密结合，暴露唾液酸受体，有利于病毒与细胞的结合。本试验表明，在细胞维持液中添加25 μg/mL胰蛋白酶能有效地促进新城疫Ⅳ系鸡胚毒在CEF上的增殖，与新城疫Ⅰ系鸡胚毒株相比，对CEF的致病变特性存在明显差异。具体表现在：新城疫Ⅳ系鸡胚毒在胰蛋白酶协助下致CEF变性、坏死、裂解过程缓慢，主要以胞浆内可见大小不等的空泡或颗粒为特征，没有典型的细胞融合或形成合胞体现象；新城疫Ⅳ系鸡胚毒感染CEF后，上清中的病毒HA最高效价比新城疫Ⅰ系鸡胚毒株低2个滴度，TCID50也较低。这些结果提示，新城疫Ⅰ系鸡胚毒株比新城疫Ⅳ系鸡胚毒具有更强的促细胞融合能力和感染力。

参考文献：

[1] 王忠田, 王泽霖, 陈溥言, 等.新城疫病毒分子生物学最新研究进展[J] .动物医学进展,2002, 23(2):33-36.

[2] 崔玉东, 冉旭华, 宋佰芬, 等.新城疫病毒Ⅰ系毒株通过Caspase途径诱导鸡胚成纤维细胞凋亡[J] .中国兽医学报, 2006，26(3):254-256.

[3] 任桂杰,王志玉.副粘病毒包膜蛋白分子生物学研究进展[J].病毒学报,2005，21(1):72-75.

[4] 金继昌,赵立红,乔健,等.NDV-Lasota毒株在鸡胚成纤维细胞上的增殖特性[J].实验动物科学,2007,24(3):20-23.

[5] 王晓旭,孙英杰,胡跃等.新城疫病毒诱导原代鸡胚成纤维细胞自噬的研究[J].中国兽医科学,2014,44(05):446-452.

[6] 豆艳丽,吴润,刘磊.鸡新城疫病毒感染不同细胞的病变特性研究[J].甘肃农业大学学报,2012,47(2):1-5.

[7] Peeters B P, Deleeuw O S , Koch G.Rescue of Newcastle disease virusfrom cloned cDNA :evidence that cleavability of the fusion protein is amajor determinant for Virulence[J]. Viral,1999,73(6):5 001-5 009.