醉马芨芨草生物碱薄层色谱分析及GC-MS检测

张睿涵 ， 李国中 ， 孙 暾 ， 达能太 ， 王建国 ， 路 浩 ， 赵宝玉

(1.西北农林科技大学动物医学院 ， 陕西 杨凌 712100 ； 2.内蒙古阿拉善左旗兽医站 ， 内蒙古 阿拉善 750300)

对于醉马芨芨草毒性成分的研究可追溯至20世纪，最开始人们认为中毒原因是其芒刺刺入动物皮肤、口腔、扁桃体等处引起物理性刺伤所致，现大量研究表明，其毒性成分是共生于植物中的内生真菌产生的生物碱[1-2]，主要是麦角新碱和麦角酰胺。但是否还含有其他类型生物碱，醉马芨芨草生物碱成分系统分析及毒性作用机制有待深入研究。

本试验采用生物碱提取方法结合薄层色谱和GC-MS法分析醉马芨芨草中所含有的生物碱数量及种类。以采自内蒙古阿拉善天然草地的醉马芨芨草为材料通过醉马芨芨草总浸膏的提取、生物碱定性检验、分段萃取、薄层色谱分析证明醉马芨芨草中存在生物碱及其所在溶剂部位、种类数。为避免杂质太多导致的GC-MS法检测结果的不准确，需先将所得浸膏使用柱硅胶层析法除杂后使用GC-MS法进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 植物材料 醉马芨芨草全草与2014年8月采集于内蒙古阿拉善盟左旗(38°49′58.76″N，105°39′43.76″E)，晒干，粉碎备用。植物标本由西北农林科技大学生命科学学院常朝阳研究员鉴定。

1.2 主要仪器与试剂 MC浙制02810218XMTB数显控温水浴锅，北京市长风仪表公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂； Canoscan LiDE 30彩色图像扫描仪，佳能公司；UV-III 三用紫外分析仪，北京炳洋科技有限公司； SHB-III循环式多用真空泵，郑州长城科贸有限公司；HP6890/5975C GC-MS联用仪，美国安捷伦公司；硅胶GF254，青岛海洋化工厂；改良碘化铋钾显色机现用现配，其他试剂均为分析纯。

1.3 醉马芨芨草生物碱的提取 本试验采用工业酒精冷浸法和工业酒精热回流法两种方法提取。工业酒精冷浸法，称取醉马芨芨草干粉5 kg置于25 L塑料桶中，倒入工业酒精没过草粉。1周更换1次工业酒精并减压回收，两月后将所得浸膏合并，计算出膏率。工业酒精热回流法，取醉马芨芨草干粉1.2 kg，分3批，每批400 g平均分装于4个1 000 mL圆底烧瓶中加适量工业酒精于60 ℃条件下热回流提取，每次热回流4 h，连续进行直至提取液澄清无色为止。提取完毕后将各批次提取液分别减压回收，将所得浸膏合并后计算出膏率。

根据生物碱的溶解性和极性依次采用酸性氯仿、碱性氯仿和碱性正丁醇对工业酒精提取部分进行分段萃取。每次萃取完后，减压回收溶剂得各部分浸膏，计算出各萃取段出膏率。

1.4 薄层色谱分析 使用自制薄层板取上述各浸膏无水乙醇溶解液，用毛细管吸取适量液体，点于距薄层板底边约0.5 cm的起始线上，点与点之间距离保持在0.5～1 cm，样点直径小于2 mm，各样点位于同一水平位置。经反复试验后选取适宜展开剂，放入展开槽中上行法展开，展开前沿距玻璃板上端1 cm时取出用电吹风机吹干，使用改良碘化铋钾显色。

1.5 硅胶柱层析法除杂纯化 将各萃取段按质量比1∶1与柱层析硅胶充分拌匀，用氯仿湿法装柱，干法上样，后依次使用氯仿、氯仿∶甲醇(50∶1)、氯仿∶甲醇(20∶1)、氯仿∶甲醇(10∶1)、氯仿∶甲醇(5∶1)、氯仿∶甲醇(3∶1)、氯仿∶甲醇(1∶1)、甲醇为洗脱剂进行洗脱，每10 mL收集一瓶，将每瓶样品使用薄层色谱法检测，并合并Rf值相同或相近的组份。

1.6 GC-MS法分析 将纯化后的样品用甲醇溶解，用GC-MS仪器检测生物碱的种类和相对含量。气象色谱条件：色谱柱为 ZB-5MSI 5% Phenyl-95% DiMethylpolysiloxane(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱，柱温 50 ℃(保留 2 min)，以 5 ℃ /min升温至 310 ℃，保持10 min；运行时间：64 min；汽化室温度 250 ℃；载气为高纯 He(99.999%)；柱前压7.65 psi，载气流量 1.0 mL/min，不分流，溶剂延迟时间：3.0 min。质谱条件：离子源为 EI 源；离子源温度 230 ℃；四极杆温度 150 ℃；电子能量 70 eV；发射电流 34.6 μA；倍增器电压 1294 V；接口温度 280 ℃；质量范围 29～500 amu。

2 结果

2.1 生物碱提取结果 使用工业酒精冷浸法提取醉马芨芨草生物碱的浸膏含量为293.21 g，出膏率为5.8%，使用工业酒精热回流法提取的浸膏含量为120.10 g，出膏率为10.01%，约为冷浸法的两倍。其中工业酒精冷浸法提取酸性氯仿段浸膏重量为2.8 g，出膏率为1.16%；碱性氯仿段浸膏重量为0.24 g，出膏率为0.1%；碱性正丁醇段浸膏重量为14.97 g，出膏率为6.23%，工业酒精热回流法提取酸性氯仿段浸膏重量为0.83 g，出膏率为0.69%；碱性氯仿段浸膏重量为0.25 g，出膏率为0.21%；碱性正丁醇段浸膏重量为18.71 g，出膏率为15.58%。

2.2 各萃取段薄层色谱分析结果 醉马芨芨草工业酒精提取部分酸性氯仿萃取段，共使用了27种展开系统进行展开，其中V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(氨水)=11∶1∶1展开效果最好，在改良碘化铋钾显色条件下有3个斑点；碱性氯仿萃取段，共使用了29种展开系统进行展开，其中V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(氨水)=7∶1∶1展开效果最好，在改良碘化铋钾显色条件下有4个斑点；碱性正丁醇萃取段，共使用了24种展开系统进行展开，其中V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶1展开效果最好，在改良碘化铋钾显色条件下有2个斑点。结果见表1。

表1 醉马芨芨草生物碱薄层色谱分析结果

2.3 醉马芨芨草各萃取段柱层析结果 酸性氯仿段共回收164份样品，经薄层色谱法分析合并为3份待测样品，分别是4-14、15-104、105-164，命名为酸性氯仿1、酸性氯仿2和酸性氯仿3；碱性氯仿段共回收246份样品，经薄层色谱法分析合并为3份待测样品，分别是66-123、132-182、183-246，命名为碱性氯仿1、碱性氯仿2、碱性氯仿3；碱性正丁醇段共回收155瓶样品，经薄层色谱法分析合并为2瓶待测样品，分别是5-111、112-155，命名为碱性正丁醇1、碱性正丁醇2。

2.4 醉马芨芨草生物碱GC-MS法分析结果 将上述8份样品使用GC-MS法分析鉴定，其中酸性氯仿1、酸性氯仿3和碱性氯仿3检测出生物碱。经质谱计算机数据系统检索及核对 Nist2008和 Wiley275 标准质谱图，酸性氯仿1共出峰63个，检出13个化合物，其中有2种生物碱，分别是甲基乙基马来酰亚胺和乙琥胺(图1、表2)；酸性氯仿2共出峰35个，检出12个化合物，其中有2种生物碱，分别是三丙酮胺和芥酸酰胺(图2、表3)；碱性氯仿共出峰29个，检出10个化合物，其中有2种生物碱，分别是槐定碱和芥酸酰胺(图3、表4)。

图1 醉马芨芨草酸性氯仿1 GC-MS总离子流图

表2 酸性氯仿1 GC-MS法检测结果

图2 醉马芨芨草酸性氯仿3 GC-MS总离子流图

图3 醉马芨芨草碱性氯仿3GC-MS总离子流图

表3 酸性氯仿3 GC-MS法检测结果

3 讨论

从醉马芨芨草生物碱提取方法结果来看，工业酒精热回流法的出膏率是冷浸法的出膏率两倍还多，从薄层色谱结果来看，生物碱显色基本没有差别，所以对于醉马芨芨草生物碱的提取，工业酒精热回流法效率更高效果更好。

表4 碱性氯仿3GC-MS法检测结果

1992年党晓鹏等[3]从采自宁夏海原南华山醉马芨芨草中分离出生物碱二氯化六甲基乙二铵，经动物毒性试验证明是醉马芨芨草的主要有毒成分，并命名为醉马草毒素；1992年汪恩强等[4]人工合成二氯化六甲基乙二铵，给马按1 000 mg/kg体重剂量口服，未复制出中毒病例。

醉马芨芨草为禾本科植物，组织中存在多种内生真菌，这些内生真菌与宿主互利共生，可提高宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力，包括抗病性[5]、抗寒性[6]、抑菌性[7]、耐重金属性[8]等。且这些内生真菌绝大多数可以在宿主植株体内产生生物碱，这些生物碱可能与引起家畜中毒有关。

1998年李学森等[9]在与新西兰研究机构的合作中发现，醉马芨芨草中含有多种生物碱且多为麦角类生物碱，其中含量最高的是麦角新碱和麦角酰胺，认为是其主要毒性物质。而早在1982年，张友杰等[10]就从采自新疆昌吉醉马芨芨草中分离出麦角新碱和异麦角新碱。而二者使用的醉马芨芨草样本都采集自新疆昌吉地区，而后兰州大学的李春杰等从采自甘肃夏河的醉马芨芨草种子培育出的植株中也检测出了麦角类生物碱。2006年桑明[11]从采自甘肃天祝的醉马芨芨草中分离出的7种生物碱，却并未检测出麦角类生物碱。根据本试验GC-MS法分析结果，从采自内蒙古阿拉善的醉马芨芨草中共检测出5种生物碱，其中含量最高的是存在于碱性氯仿段的槐定碱(sophoridine)，与桑明分离出的生物碱无一一致，也未检出文献中报道的麦角类生物碱麦角新碱和麦角酰胺。这也许与醉马芨芨草生长环境、生物碱提取方式有关。

据药典介绍，麦角新碱是一种极性很大的化合物，但在本试验正丁醇段并未检出生物碱，并且在该段有几种含量很高的化合物也未检出(保留时间：16.9，相对含量57.808%、保留时间：31.858，相对含量：24.483%)，可能与质谱数据库大小有关。代乐英等[12]研究表明，带内生真菌的醉马芨芨草植株均能检测到不同含量的麦角生物碱，而不带内生真菌的植株均未能检测出这两种生物碱。故在本试验中检测出的5种生物碱究竟是内生真菌产生的还是植株自身产生，内生真菌是否会选择性的产生生物碱还有待研究。至于这批从内蒙古阿拉善采集的醉马芨芨草的毒性大小，也有待进一步试验验证。

参考文献：

[1] 李春杰，南志标，张昌吉，等．醉马草内生真菌对家兔的影响[J]．中国农业科技导报，2009，11(2)：84-90.

[2] 梁莹．醉马草内生真菌共生体对小尾寒羊的影响[D]．兰州：兰州大学，2011．

[3] 党晓鹏，曹光荣，段得贤，等．醉马草的有毒成分研究[J]．畜牧兽医学报，1992，4(23)：366-371．

[4] 汪恩强．醉马草有毒成分：二氯化六甲基乙二铵的合成和毒理研究[D]．杨凌：西北农业大学，1992．

[5] Xia C, Zhang X, Christensen M J,etal. Epichloё endophyte affects the ability of powdery mildew ( blumeria graminis ) to colonise drunken horse grass ( achnatherum inebrians )[J].FungalEcology, 2015，16(4): 26-33.

[6] Chen N, He R, Chai Q,etal. Transcriptomic analyses giving insights into molecular regulation mechanisms involved in cold tolerance by epichloё endophyte in seed germination of achnatherum inebrians[J]. Plant Growth Regulation, 2016，1-9.

[7] 孙一丹, 张兴旭, 古丽君,等.醉马草-内生真菌共生体中生物碱的抑菌活性[J]. 草业科学, 2015，32(4): 508-514.

[8] 王萍, 张兴旭, 赵晓静,等.重金属胁迫对醉马草生长及生理生化指标的影响[J]. 草业科学, 2014，31(6): 1 080-1 086.

[9] 李学森，张学洲，顾祥，等．醉马草有毒物质与其内生真菌的关系[J]．草食家畜，1998(4)：44-46．

[10] 张友杰，朱子清．醉马草化学成分的研究[J]．高等学校化学学报，1982(3)：150-151．

[11] 桑明，张继，姚健，等．醉马草毒性成分的分析研究[J]．畜禽业，2006(12)：9-11．

[12] 代乐英，黄玺，李春杰，等．麦角生物碱在醉马草内生真菌共生体中的空间分布[J]．草业学报，2010，19(6)：215-221．