养殖大鲵恶臭假单胞菌的分离鉴定及药物敏感性分析

杨 敏 ， 吴 青 ， 沙 莎

(西南大学荣昌校区动物医学系 ， 重庆 荣昌 402460)

随着我国大鲵驯养繁殖研究的成功开展，人工养殖大鲵规模的逐渐扩大，同时面临着各类疾病的威胁，大鲵细菌性病害更是一类常见且危害性大的疾病，现已发现的病原菌有温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、柱状黄杆菌、维氏气单胞菌、迟钝爱德华菌、恶臭假单胞菌[1-6]等。恶臭假单胞菌为假单胞菌属一种常见的条件致病菌，广泛存在于水体和土壤中。近几年无相关报道恶臭假单胞菌引起大鲵发病，本次研究对重庆某大鲵养殖基地病死大鲵经细菌的分离鉴定，生物学特性，理化性质及BIOFOSUN-GN48微生物自动分析系统鉴定，结合16S rDNA PCR鉴定结果,进行测序，构建系统发育树，并进行了致病性试验和药物敏感性试验，以期为大鲵病原菌研究提供科学依据，对大鲵疾病防治、生产养殖提供参考，也为进一步深入研究恶臭假单胞菌致病机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 病死大鲵来自重庆某人工养殖基地；健康鲫鱼30尾，长度 10～12 cm/尾，购自重庆荣昌区某鱼类养殖场；药敏试纸，购自杭州天和微生物试剂有限公司；中药材，购自重庆荣昌区中药专卖店。

1.2 主要试剂 营养琼脂、克氏双糖铁、麦康凯琼脂，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；PCR扩增测序试剂由上海生工生物工程技术服务有限公司提供

1.3 方法

1.3.1 细菌的分离培养 取病死大鲵的肾脏、脾脏、肝脏等组织接种在营养琼脂上，在28 ℃下恒温培养24 h后，挑取优势菌落在普通营养培养基上分离培养，获纯培养物，将从肾脏分离菌编号为KN-4。接种血平板、麦康凯、KIA培养基，28 ℃恒温培养24 h，观察菌落特征，涂片、染色、镜检。

1.3.2 鲫鱼致病性试验 接种KN-4纯培养物到营养肉汤中， 28 ℃震荡培养18 h，使菌液浓度约为1.5×108CFU/mL，用于感染鲫鱼。将鲫鱼随机分3组：试验组、生理盐水组、空白组分别10条鲫鱼。分别从鲫鱼腹鳍根部将试验组注射0.5 mL菌液，生理盐水组注射0.5 mL生理盐水，空白组不做处理。观察记录发病及死亡情况，对死亡的鲫鱼剖检，分离，染色镜检 。

1.3.3 细菌生化鉴定 取纯培养物进行氧化酶试验，同时接种在肉汤培养基中，28 ℃培养16～24 h后，进行BIOFOSUN-GN48微生物自动分析系统鉴定，参照文献[7-9]进一步鉴定。

1.3.4 16S rDNA PCR 鉴定 采用上海生工生物工程技术服务有限公司合成的通用引物：上游引物，5′-AGAGTTTGACCTGGCTCAG-3′；下游引物，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系(12.5L)： DNA模板1L，6.25L的premix ，上游下游引物各0.5L, 超纯水4.25L。 反应条件：94 ℃预变性10 min，再置于94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min 30 s，总共循环30次，最后在72 ℃延伸5 min。将PCR产物置于1%琼脂糖凝胶电泳中检测。PCR产物递送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。将所得序列在NCBI上经由BLAST对比后，运用MEGA 5.0软件进行同源性分析，并构建系统发育树。

1.3.5 药敏试验 采用纸片扩散法对KN-4菌株进行哌拉西林、丁胺卡那霉素、头孢他啶、米诺环素等32种抗生素的药敏试验。28 ℃下培养24 h后，测定并记录抑菌圈的直径，敏感性判定参照CLSI 2014抗微生物药物敏感性试验的执行标准。

1.3.6 中药试验 购买苦参、连翘、甘草等14种中药材分别取20 g,进行粉碎、浸泡煎煮、过滤,合并3次煎煮液，取滤液浓缩至1 g/mL。取纯培养菌，用生理盐水稀释至1.5麦氏比浊标准，均匀涂布在平板上，4点法放入牛津杯，同一种药液做3个平行，每个加200L药液，一个空白对照，加200L蒸馏水，28 ℃培养24 h后观察结果。测定并记录抑菌圈的直径大小。

2结果

2.1 细菌的分离培养结果 从病死大鲵肾脏分离1株优势菌，编号为KN-4，在营养琼脂上生长，菌落露滴状圆形，淡黄色，边缘整齐，湿润光滑。在麦康凯培养基上生长良好，菌落呈圆形，灰黄色。KIA斜面上下颜色均无变化。血平板上出现α溶血现象。革兰染色镜检，为阴性杆菌。

2.2 鲫鱼致病性试验结果 试验组鲫鱼1周内全部死亡，空白组和生理盐水组未见死亡(表1)。剖检死亡鲫鱼，无明显病理变化，取腹水、肝胰、肾脏病料进行细菌分离纯化鉴定，在各脏器中分离得到优势菌与KN-4菌株的生物学特性呈现高度的一致。

表1 KN-4菌株对健康鲫鱼的感染试验

-:不做任何处理

2.3 细菌的生化鉴定结果 KN-4菌为革兰阴性非肠杆菌，氧化酶阳性，不发酵D-果糖、D-半乳糖、麦芽糖等，D-甘露醇、D-山梨醇、D-阿糖醇为阴性，可利用肌苷、L-亮氨酸、L-焦谷氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸等。BIOFOSUN-GN48微生物自动分析系统定鉴定结果显示与恶臭假单菌相符合的概率为100%，相似指数0.825，位距指数2.585。即KN-4菌株表型特征与恶臭假单胞菌的相似程度和匹配程度均较高[10]。结果见表2。

2.4 16S rDNA PCR 鉴定结果 将 KN-4菌株基因组进行PCR扩增，产物在1%琼脂糖凝胶电泳中显示出目的条带大小约为1 500 bp(见图1第4条带)，递交上海生工生物工程技术服务有限公司测序，得到大小为1 443 bp的序列。在NCBI上选取与KN-4菌株同源性达到99%以上的18种假单胞菌属不同种细菌，经MEGA 5.0软件制作16S rDNA系统发育树和同源性比对图(图2、3)，KN-4菌株与恶臭假单胞菌(登陆号为FJ262368)和假单胞菌不定种(登陆号为FJ976654)在一个分支上，置信度为98.9%，亲缘性最为相近[11]。

表2 KN-4株的生理生化特性

注 +：阳性；-：阴性

2.5 药敏试验结果 KN-4菌株对头孢他啶(CAZ)、丁胺卡那霉素(AMK)、新霉素(FRM)、多黏菌素B(PLB)、头孢曲松(CRO)表现为高度敏感；而对氨苄西林(SAM)、多西环素(DOX)、庆大霉素(GEN)等27种抗生素耐药(表3) 。

图1 PCR扩增结果

图2 KN-4分离株系统发育树

图3 16S rDNA 的同源性比较

表3 分离株K N-4药敏试验结果

S：敏感；R：耐药

2.6 中药试验结果 中药抑菌试验中连翘、苦参、甘草、鱼腥草、黄连、黄芩、老鹤草对KN-4具有较强抑菌活性，板蓝根、蒲公英、当归、夏枯草、金银花、五倍子、大黄对其无抑菌作用[12]。

表4 分离株KN-4的中药试验结果

-：无抑制作用

3 讨论

恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)为假单胞科(Pseudomonadaceae)假单胞属(Pseudomonas)，革兰阴性需氧杆菌，无芽孢，触酶阳性，氧化酶阳性，不发酵糖，在麦康凯培养基上生长，广泛存在于土壤、水、植物以及腐物中，同时也是海淡水鱼类肠道菌群的重要成员之一[13]。分离菌株KN-4的16S-rDNA PCR鉴定结果显示，KN-4菌株与恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)(登陆号为FJ262368)和假单胞菌不定种(Pseudomonassp.)(登陆号为FJ976654)亲缘性最为相近[11]。其表型鉴定用BIOFOSUN-GN48微生物自动分析系统测定结果与恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)相符。可确定KN-4 菌株是恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)(登陆号为FJ262368)。

在国内的研究报道中恶臭假单胞菌可引发欧洲鳗鲡[14]、罗氏沼虾[15]、黑鲷[16]、大黄鱼[15-16]、大鲵[6]等患病。引起患病的原因可能是大鲵食用了不新鲜的饵料鱼，饵料污染了恶臭假单胞菌随食物进入肠道，细菌异常增生，侵袭肾脏，引起大鲵死亡或发病[6]。在本次研究中KN-4菌株对鲫鱼的攻毒试验中表现较强的毒力，试验鲫鱼死亡率达100%。在大鲵肾脏分离到致病菌KN-4，说明恶臭假单胞菌易在肾脏富集并侵害肾脏，另一方面鲫鱼致病性试验说明鲫鱼也是恶臭假单胞菌易感的对象，并可造成较严重的损害。同时也验证了其他研究者认为多种鱼为恶臭假单胞菌的易感对象的结果[15]。鉴于KN-4对鲫鱼的高致病性，可以推断养殖场在养殖中给大鲵饲喂冻鱼饵料和活饵料过程中污染了恶臭假单胞菌，这种高致病性恶臭假单胞菌有机会进入大鲵机体，可与其他因素结合从而造成大鲵发病的可能性提高。

恶臭假单胞菌对抗生素敏感性研究作为大鲵治疗有重要意义。赵虎等在2008年测得大鲵恶臭假单胞菌对舒普深(头孢哌呱酮舒巴坦)、呋喃妥因敏感，同年沈锦玉等[17]测得网箱养殖大黄鱼恶臭假单胞菌对卡那霉素、庆大霉素、吡哌酸、四环霉素等敏感；2012年任燕等[18]研究报道大黄鱼恶臭假单胞菌病原对卡那霉素、庆大霉素等敏感；许斌福[19]等在2015年研究报道中，显示大黄鱼恶臭假单胞菌对卡那霉素敏感。许多的研究结果[6，17-19]显示，不同地域不同菌株及试验鱼种类的差异，都可能导致耐药性的产生。在我们的研究中KN-4菌株对头孢他啶、丁胺卡那霉素、新霉素、多黏菌素B、头孢曲松较为敏感；对庆大霉素、舒普深(头孢哌呱酮舒巴坦)、呋喃妥因、卡那霉素、吡哌酸、四环素表现为耐药。我们及相关研究者们的结果反映了近8年恶臭假单胞菌对头孢哌呱酮舒巴坦、呋喃妥因、卡那霉素等抗生素从敏感已经变成耐药的现象。因此恶臭假单胞菌耐药机制及合理应用抗生素类药物用于大鲵治疗具有重要意义。

另外，我们对恶臭假单胞菌的中药抑菌试验研究结果显示，连翘、苦参、甘草、鱼腥草、黄连、黄芩、老鹤草分别对KN-4菌株具有较强抑菌活性。使用中药防治大鲵或鱼类恶臭假单胞菌引起的疾病较使用抗生素有一定的优势，一定程度上可避免多重耐药性的不断产生。可以为研究提取新药防治大鲵细菌性病害提供参考，为中药在水产养殖业的疾病防治方面提供实验依据。

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