长春市售乌鳢携带嗜水气单胞菌情况调查

单晓枫 ， 张冬星 ， 康元环 ， 孙武文 ， 吴同垒 ， 王桂芹 ， 钱爱东

(1.吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林 长春 130118 ； 2. 河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室 ， 河北 秦皇岛 066004)

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)是气单胞菌科气单胞菌属的代表株，对人及多种动物均具有一定的致病性，是典型的人、兽、水生动物共患病原菌[1]。其分布广泛，可作为水生动物正常菌群存在于肠道中，当机体抵抗力下降可自身感染或通过粪便等排出体外而感染其他易感动物，甚至当人类在处理相关食材不得当时也易被其感染而发病。

乌鳢(Channaargus)是一种经济价值与营养医学价值均较高的鱼类，其肉质鲜美、抗逆性强，可以抵抗多种传染性疾病[2]，很多病原可以寄生其体内而不引起乌鳢死亡，与其他水生动物混养可能会造成其疾病的发生，人类如果食用消毒不彻底的乌鳢或食材前处理操作不得当，可能会感染人类而对机体造成危害。而具有致病性的嗜水气单胞菌可能作为乌鳢肠道菌群潜伏在体内，一旦该菌接触到其他水生动物或人类，可能造成感染引发疾病。因此，本调查以长春市市售乌鳢为研究材料，对其体内携带嗜水气单胞菌情况进行调查，研究结果为使用乌鳢的公共卫生安全，以及预防嗜水气单胞菌感染人及动物引发疾病提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 菌种与实验动物 嗜水气单胞菌标准株ATCC7966，本实验室保存。昆明系小鼠，体重约15g/只，购自吉林省实验动物中心；斑马鱼，购自长春市某花鸟鱼市场。

1.2 主要试剂 RS鉴别培养基、AHM培养基，购自北京陆桥生物技术责任有限公司；细菌微量生化反应管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；TaqDNA聚合酶、DNA凝胶回收试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司；其他试剂，均为国产或进口分析纯。

1.3 样品采集 采样时间，2016年5—10月；采集长春市水产市场表观健康乌鳢，活体运送至实验室、麻醉、表面消毒，无菌条件下采取乌鳢肠道，保存。

1.4 细菌的分离鉴定 无菌操作取肠道内容物接种于RS培养基，28 ℃ 培养 18 h，随机挑取5个特征性菌落接种液体LB培养基，28 ℃ 培养 12 h，再次用RS培养基分离培养，挑取单个菌落纯培养。参照陆承平制定的国标队纯化的菌株进行初步鉴定[3]。

将初步鉴定为嗜水气单胞菌的菌株用热裂解法提取基因组，以储卫华[4]设计的特异性16S-rRNA基因引物对其进行PCR扩增(见表1)，1%琼脂糖凝胶电泳检测，随机挑取685 bp左右出现条带者、纯化其PCR产物，送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果与GenBank进行比对，已验证PCR反应正确性。将最终鉴定为嗜水气单胞菌的菌株进行冻干保存。

1.5 细菌携带毒力基因检测 以上述鉴定为嗜水气单胞菌分离株基因组DNA为模板，对嗜水气单胞菌的气溶素(aer)、丝氨酸蛋白酶(ser)、溶血素(hly)、黏附素(Aha)、细胞毒性肠毒素(act)以及群体感应系统调控基因(LuxS)等6个毒力基因片段进行扩增(见表1)[4-7]。

1.6 代表菌株致病性试验 选取携带不同毒力基因的嗜水气单胞菌分离株，分别以斑马鱼、昆明系小鼠为实验动物进行致病性试验，观察一周，记录死亡情况；同时设阴性对照组。统计结果以Reed与Muench的方法计算LD50。

2 结果

2.1 细菌分离株理化鉴定结果 经RS鉴别培养基分离，共获得菌落为黄色、圆形的分离株301株，纯化后，按国家标准GB /T 1865222002进一步鉴定：

表1 PCR反应所用的引物及目的片段大小

选取AHM培养基顶部紫黑色、底部黄色，运动性阳性，氧化酶阳性，吲哚阳性，葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七叶苷、水杨苷阳性，革兰阴性的分离株，初步定为嗜水气单胞菌。进行分子生物学鉴定。

2.2 细菌分子生物学鉴定 对初步鉴定为嗜水气单胞菌的分离株，通过嗜水气单胞菌16S rRNA特异性而进行PCR鉴定，电泳检测，在685 bp左右出现目的条带的菌株可判定为嗜水气单胞菌阳性。随机选取分离株PCR扩增产物测序，经GenBank比对，证实所测分离株为嗜水气单胞菌。

经理化试验、分子生物学鉴定结果综合判定，共获得107株嗜水气单胞菌，所占分离株比例为35.55%。

2.3 细菌分离株携带毒力基因检测结果 除LuxS基因外，107株嗜水气单胞菌分离株携带5种毒力基因检测结果如下：5种毒力基因都存在的菌株占14.0%(15/107)、携带4种毒力基因的菌株占20.56%(22/107)、携带3种毒力基因的菌株占20.56%(22/107)、携带2种毒力基因的菌株占17.76%(19/107)、只有1种毒力基因的菌株占11.21%(12/107)、5种毒力基因均没有的菌株占15.89%(17/107)。

107株嗜水气单胞菌分离株中携带aer基因的菌株有87株(81.31%)、携带hly基因的菌株76株(71.03%)、携带act基因的菌株32株(29.91%)、携带Aha基因的菌株37株(34.58%)、携带ser基因的菌株82株(76.64%)。作为群体感应系统的标志基因LusX，有88.79%(95/107)的菌株携带该基因。

2.4 代表菌株致病性实验结果 随机选取携带0种、1种、2种、3种、4种、5种毒力基因(LusX基因除外)嗜水气单胞菌分离株各1株，分别对小鼠及斑马鱼进行LD50的测定，其菌株毒力基因型及对小鼠、斑马鱼LD50结果如表2所示。从表中可以看出，携带毒力基因的菌株对小鼠、斑马鱼均有一定的致病性；且随着菌株携带毒力基因数的增多，致病力也随之增强；而同一菌株对斑马鱼的致病力要强于小鼠。

表2 嗜水气单胞菌代表株致病性试验

3 讨论

乌鳢肉质鲜美，是我国淡水鱼类生鱼片的主要食材，但其抗逆性也较强，体内往往携带多种病原生物而自身不发病；其中，体内存在的嗜水气单胞菌是典型的人-兽-鱼共患病病原菌，其致病菌株可感染混养的其他鱼类，也可能感染接触该菌的人类。

本试验检测，长春市水产市场表观健康的乌鳢体内嗜水气单胞菌分离率为35.55%(107/301)，这与我国其他鲜活水产品嗜水气单胞菌携带率有所差异[8-10]，可能与样品不同、采样时间不同有一定关联。试验对嗜水气单胞菌分离株5种毒力相关基因进行了检测，结果发现，超过70%以上的菌株携带aer、ser、hly基因，而大量研究证实，气单胞菌aer、ser基因与菌株的致病性有较大的关联；本试验的致病性结果也显示，携带aer、ser、hly基因的分离率对小鼠及斑马鱼具有一定的致病性。通过以上结果是否可以提出一种假设：乌鳢体内携带大多数嗜水气单胞菌分离株均存在潜在的致病风险？这需要进一步实验验证。

本试验也对LusX基因进行了检测，结果显示，有88.79%(95/107)的嗜水气单胞菌分离株携带该基因，LusX基因与细菌的群体感应密切相关，而群体感应系统与细菌致病性、生物被膜的形成以及耐药性具有一定关联[11]，携带该基因嗜水气单胞菌分离株的大量存在，暗示这些细菌在宿主体内可能形成生物被膜，一旦这些菌株引发疾病，其形成的生物被膜可能会给用药带来较大困难。

参考文献：

[1] Janda J M, Abbott S L. The genusAeromonas:Taxonomy, pathogenicity, and infection[J]. Clinical Microbiology Reviews, 2010, 23(1): 35-73.

[2] 吴同垒，单晓枫，王桂芹，等. 乌鳢主要病害的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医，2011,17(9):29-31.

[3] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. GB /T 1865222002致病性嗜水气单胞菌检验方法[S].北京: 中国标准出版社, 2002.

[4] 储卫华. 嗜水气单胞菌临床分离株胞外毒力因子的检测[J]. 中国兽医杂志, 2006, 42(1): 49-50.

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[8] 李焕荣, 崔德凤, 孙铁海. 北京集贸市场淡水鱼类致病性嗜水气单胞菌的调查[J]. 中国兽医杂志, 2002, 38(6): 45-46.

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