18株不同源多杀性巴氏杆菌耐药性分析

王 羽 ， 董文龙 ， 王 巍 ， 盛宇轩 ， 张喜庆 ， 马红霞 ， 高云航

(吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林 长春 130118)

多杀性巴氏杆菌病是动物临床中的常见病, 其抗原性及宿主特异性的不同, 造成临床动物发病症状也大不相同，可以引发猪肺疫，牛出血性败血症，禽霍乱，给养殖户带来了巨大的经济损失。

动物源性巴氏杆菌的耐药性倍受人们关注，细菌对某一类具有相同或是相似结构抗菌药物耐药的产生，可能是抗菌药物新作用位点的产生或是作用位点的改变[1]。但随着抗菌药物的不合理应用，特别是将抗菌药物以次治疗剂量添加到饲料中，导致多杀性巴氏杆菌的耐药率不断提高，耐药范围更广，多重耐药的现象越来越多。因此对动物治疗要合理用药、合理用量，避免耐药性的产生。

整合子是细菌基因组中一种介导耐药基因转移的专座元件，其功能与细菌耐药产生与转移密切相关[2-4]。本试验通过微量稀释法药敏试验、耐药基因及其整合子扩增确定了该18株多杀性巴氏杆菌耐药性及其Ⅰ型整合酶携带率。

1 材料与方法

1.1 菌种 18株多杀性巴氏杆菌由吉林农业大学动物科学技术学院预防兽医学研究室分离保存。12株牛源多杀性巴氏杆菌分离自吉林省不同肉牛养殖场患有肺炎的肺脏组织(分别命名为Pa1，Pa2，Pa3，Pa4，Pa5，Pa6，Pa7，Pa8，Pa9，Pa10，Pa11，Pa12)，6株猪源多杀性巴氏杆菌分自吉林省不同猪场患有肺炎的肺脏组织(分别命名为Pm1，Pm2，Pm3，Pm4，Pm5，Pm6)。

1.2 主要试剂 胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)，购自青岛高科园海博生物技术有限公司；胎牛血清，购自北京元亨圣马生物技术研究所；ExTaq酶、dNTP、DNA Marker 2 000、6×Ex Buffer等，购自TaKaRa公司，细菌基因组提取试剂盒、胶回收试剂盒等，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；质粒小量提取试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 MIC试验 将多杀性巴氏杆菌接种到TSB液体培养基中(含50 mL/胎牛血清)，37 ℃水平摇床170 r/min培养18 h。将多杀性巴氏杆菌菌液进行倍比稀释，选取浓度为1×106CFU/mL的菌液作为标准液进行抗菌药物敏感性试验。

参考CLSI动物源细菌药敏试验标准，分别以敏感(S)、中介(I)和耐药(R)3种形式对药物敏感性进行分析。

1.4 DNA提取及PCR鉴定 采用Primer(版本为5.0)软件根据GenBank已登陆的四环素类耐药基因tetB、tetG、tetK、tetO、tetQ、tetB及Ⅰ型整合酶Int I序列进行引物的设计。引物序列送上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。

表1 Ⅰ型整合酶和四环素类引物序列及预计大小

挑取单个菌落接种于TSB液体培养基中(含50 mL/胎牛血清)，置于37 ℃水平摇床(170 r/min)增菌培养。取1.6 mL菌液12 000 r/min离心，弃上清，参考细菌基因组提取试剂盒说明书提取分离菌株DNA。

Ⅰ型整合酶PCR反应条件如下：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，退火57 ℃ 1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min；四环素类耐药基因PCR反应条件如下：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，退火(6种耐药基因的退火温度参照表1)30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min；PCR反应结束后，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。

对PCR产物进行胶回收纯化，纯化产物和pMD-18T连接过夜，将连接产物转化到E.coliDH5α 感受态细胞，按照试剂盒说明书提取质粒进行验证，并送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序结果与GenBank中已知基因序列进行Blast比对。

2 结果

2.1 MIC试验结果分析 18株多杀性巴氏杆菌对8种抗生素的耐药情况见表2。

表2 多杀性巴氏杆菌耐药结果

2.2 四环素耐药基因扩增结果

2.2.1tetA耐药基因扩增结果 采用PCR技术对tetA耐药基因进行扩增，18株Pm均未检测到tetA耐药基因。

2.2.2tetB耐药基因扩增结果 菌株Pm1、Pm3、Pm4与Pa11扩增出200 bp左右的片段，该基因片段测序后使用Blast对其碱基序列进行分析，其结果显示，所扩增的tetB相应序列与GenBank上已登录的耐药基因tetB(登录号NG-048170.1)序列同源性为100%。结果如图1。

2.2.3tetG耐药基因扩增结果 18株P.multocida均扩增出约400 bp大小的片段，根据Blast对比结果可知，与GenBank上已登录的耐药基因tetG(登录号NG-051907.1)同源性为93%，结果如图2。

图1 P.multocida的tetB 基因扩增结果

图2 P.multocida的tetG基因扩增结果

2.2.4tetK耐药基因扩增结果 菌株Pa1、Pa2、Pm1、Pm2、Pm3扩增出200 bp左右的片段，该基因片段测序后使用Blast对其碱基序列进行分析，其结果显示，所扩增的tetK相应序列与GenBank上已登录的耐药基因tetK(登录号KR362248.1)序列同源性为100%。结果如图3。

图3 P.multocida的tetK 基因扩增结果

2.2.5tetO耐药基因扩增结果 仅Pm10扩增出约200 bp大小片段，与预期片段大小相符，根据Blast对比结果可知，菌株Pm10扩增序列与GenBank上已登录的耐药基因tetO(登录号KR362248.1)同源性为100%。结果如图4。

2.2.6 tetQ耐药基因扩增结果 菌株Pa2、Pa4、Pa5、Pm1、Pm2约200 bp的片段，将测序结果与GenBank中已知基因序列进行Blast比对，5株菌株扩增序列已登录的耐药基因tetQ(GQ343142.1)序列同源性达到98%。结果如图5。

图4 P.multocida的tetO基因扩增结果

图5 P.multocida的tetQ 基因扩增结果

2.3 Ⅰ型整合酶扩增结果 菌株均扩增出280 bp左右的片段，测序结果为Pa1、Pa2、Pa12与GenBank登录的Ⅰ型整合酶(MF168945.1)同源性均为100%。Pa6为99%。结果如图6。

图6 Ⅰ型整合酶基因扩增结果

3 讨论

研究表明，猪源多杀性巴氏杆菌在氯霉素、痢特灵、羧苄青霉素、链霉素、丁胺卡那霉素等抗生素中对氯霉素、羧苄青霉素、链霉素、卡那霉素均耐药[5]。孔令聪分离得到12株牛源多杀性巴氏杆菌，耐药检测分析显示，此12株菌对新诺明、链霉素高度耐药[6]。在本研究中，试验结果显示，18株不同源的多杀性巴氏杆菌对氯霉素的耐药率为83.33%，对四环素、强力霉素与庆大霉素的耐药率为50%～61.11%，对氧氟沙星、卡那霉素、恩诺沙星与氟苯尼考的耐药率为27.78%～38. 89%。18株不同来源的多杀性巴氏杆菌表现出不同药物的敏感性从而为指导临床科学用药提供依据。

四环素类药物为广谱抗生素, 广泛用于临床治疗, 并常被用做动物促生长剂，四环素类药物产生耐药性的机制主要有核糖体保护作用、外输泵作用及产生钝化酶等[7]。在本研究中未检测到tetA耐药基因；22.22%多杀性巴氏杆菌携带tetB耐药基因，5.56%多杀性巴氏杆菌携带tetO耐药基因；tetK与tetQ两种耐药基因的携带率均为27.28%，而对于tetG的携带率为100%。

根据整合酶序列不同，整合子可分为6型，以Ⅰ型整合酶最为常见[8-9]。在实验中发现多杀性巴氏杆菌Pa1、Pa2、Pa6与Pa12携带Ⅰ型整合酶且Pa1、Pa2、Pa6与Pa12有着相似耐药谱，有可能在此4株菌株中发生了耐药传播。所以持续监测细菌耐药性对选择有效抗菌药物治疗疾病是非常重要的。随着细菌耐药性逐渐增加，应该减少抗菌药物的应用，避免细菌耐药性的产生。

参考文献：

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