CRISPR-Cas9基因编辑系统研究进展

孙 伟，刘杉杉

(1.铜仁职业技术学院农学院，贵州铜仁 554300；2.铜仁职业技术学院民族中兽药分离纯化技术国家地方联合工程研究中心，贵州铜仁 554300)

规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein)组成的CRISPR-Cas系统,广泛存在于细菌和古生物菌中，是微生物在长期进化的过程中形成的一种免疫系统，可通过RNA介导的核酸酶抵抗噬菌体入侵、阻止质粒接合和转化等基因的导入[1]。早期根据Cas蛋白的不同，将CRISPR系统分为Ⅰ～Ⅲ类[2]。随着高通量测序技术的发展，现在发现有Ⅰ-Ⅵ共6种类型，其中CRISPR-Cas9是由Ⅱ型系统改造而成的一把新的“基因剪刀”，在许多原核生物和真核生物体内得到成功应用[3-4]。

基因编辑技术是基因功能研究的重要手段，并得到了迅速的发展。近年来，发展了多种基因编辑技术，其中有锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)、类转录激活因子效应核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)和CRISPR-Cas9系统，均可实现DNA水平的基因编辑。ZFN和TALEN通过蛋白质和DNA识别发挥作用，与ZFN和TALEN不同的是，CRISPR-Cas9通过一小段RNA序列对DNA进行识别，因此具有设计简便、高效、可实现高通量操作的特点[5]。目前，CRISPR-Cas9 系统在基因编辑方面得到了迅速的发展，在多个领域的研究中得到了应用。

1 CRISPR-Cas系统的起源

1987年，Ishino Y等[6]在K12型大肠埃希菌编码碱性磷酸酶的基因附近，发现了一种特殊的DNA回文序列，但不知道其功能。直到2000年，Mojica F J等[7]才在细菌和古细菌中发现了CRISPR系统，并在随后的研究中发现，这些CRISPR系统在细菌先天性免疫中具有重要的作用。

2 CRISPR-Cas9系统的组成和原理

2.1 系统组成

CRISPR-Cas9系统由具有核酸酶活性的Cas9蛋白、CRISPR转录而来的crRNA和反式激活的CRISPR重复区互补的tracrRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)组成。其中，crRNA决定了识别序列的特异性，crRNA与tracrRNA形成复合体招募Cas9到特定基因位点发挥内切酶活性。每个crRNA包含20 nt的引导序列，可与靶DNA序列通过碱基配对的方式结合。Cas9蛋白发挥酶活性对靶序列有效的切割还依赖于靶序列的3′ 端存在的相邻原型间隔序列毗邻基序(parotospacer-associated mMotif,PAM)[1]。来源于化脓链球菌Cas9的PAM识别序列为5′ -NGG。为了简化操作过程，研究者将crRNA和tracrRNA融合到同一条单链引导RNA(single guide RNA,sgRNA)中[8]。通过改造后的CRISPR-Cas9系统只需要单独的Cas9在gRNA的引导下,完成对DNA双链的定点切割，造成DNA双链断裂(double-strand break，DSB)[1]。

2.2 工作原理

Cas9蛋白通过sgRNA中的碱基互补区序列特异性识别和结合目标DNA序列，并在目标DNA双链的特定位点对其进行切割形成DSB。在真核生物中，基因位点一旦被Cas9切割会在体内启动两种修复机制，即同源重组修复(homologous recombination,HDR)和非同源末端连接修复(non homologous end joining，NHEJ)[1]。正常情况下，机体通过HDR后不会改变目标基因编码序列，但是当存在供体质粒提供的同源位点时也可以通过同源重组的方式插入外源基因片段，HDR途径可以对Cas9切割的目标DNA序列进行精确的编辑。有错误倾向的NHEJ，在修复过程中往往伴随有碱基的缺失或插入，甚至出现大片段的缺失或颠倒移位，从而造成所编码的基因提前终止或编码错误的蛋白。尽管一些细菌不存在有效的NHEJ途径，但是Cas9可以特异导入细菌基因组中，CRISPR-Cas9可对细菌基因组进行编辑。因此，利用DNA损伤修复的原理，可实现DNA的缺失、插入，利于基因功能的研究。

3 CRISPR-Cas9系统的设计

3.1 sgRNA的设计

Cas9核酸酶的特异性取决于PAM序列上游的20 nt的引导序列。研究表明，PAM上游被称为“种子区”的12 nt的序列对于Cas9发挥酶切作用起到重要的作用。“种子区”一旦发生错误匹配，对靶位点的识别具有很大的影响[9]。因此，在设计sgRNA时候，要寻找目标DNA中Cas9识别的PAM序列，同时也要考虑基因编辑中尽可能降低脱靶率。目前，多个CRISPR在线设计的软件可供使用，其中http://crispr.mit.edu可对提交的目标DNA序列包含的所有具有PAM序列进行分析，通过对产生的sgRNA进行系统评分，可简化设计难度，并可以对存在的脱靶率进行理论上的分析，这样有助于提高人工选择的效率。

3.2 影响Cas9蛋白打靶效率的因素

在设计sgRNA的过程中，靶DNA基因组序列中高GC含量有利于寻找Cas9识别的PAM序列5′NGG，但是过高的GC含量也会提高Cas9脱靶率[10]。一般GC含量在45%～60%为宜。考虑到内含子对基因编码的终产物意义不大，因此在设计sgRNA时，应该选取基因编码的CDS区。不同的靶点在基因敲除效率上存在较大的差异，具体原因尚不明确。因此，在靶点的选择上可以选择2个～3个位点，可以在一定程度上提高打靶率。必要的时候可以在基因库中对靶点进行BLAST分析。此外，通过验证载体也有利于筛选出高打靶率的sgRNA序列。

4 CRISPR-Cas9系统的应用

近几年来，CRISPR-Cas9技术发展迅速，在多种真核细胞、病毒，甚至一些细菌上得到了应用，为基因功能的研究和抗病育种、疾病治疗等方面的研究提供了新的思路和手段。

4.1 对真核生物进行基因编辑

CRISPR-Cas9系统在对真核生物进行基因编码方面具有很广泛的应用前景。目前，利用CRISPR-Cas9系统在人类细胞、小鼠、猪等多种真核生物上实现了基因编辑。2013年Cong L等[11]首次利用CRISPR-Cas9技术实现了人类细胞双基因缺失,同年，Mali P等[12]在人的干细胞上实现了基因编辑。邵峰等[13-14]采用该项技术将人的原代细胞、癌细胞和小鼠中表达的与焦亡相关的gsdme、gsdmd基因进行敲除。该技术可实现在动物胚胎水平进行基因编辑，从而产生具有稳定基因缺少突变的后代。目前，已有多家研究机构采用CRISPR-Cas9技术，在猪受精卵发育过程中，将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)CD163受体的基因缺失，成功培育出具有抗PRRSV感染的基因缺失猪[15-16]，有望对PRRSV的有效防控起到一定的作用。Gao Y等[17]采用CRISPR-Cas9技术培育出抗结核病的牛，这些研究成果为动物疾病防控和抗病育种工作提供了新的思路和手段。

肿瘤和癌症是目前死亡率很高而且很难治愈的疾病。下调表达相关的致癌基因，对于肿瘤的治疗具有十分重要的意义。通过设计可识别人的乳头瘤病毒(Human papilloma virus， HPV)致癌基因E6/E7启动子的CRISPR-Cas9系统，可显著降低HPV导致的宫颈癌细胞的增殖。利用CRISPR-Cas9技术抑制泌尿道上皮细胞癌相关因子1(urothelial carcinoma associated 1,UCA1)的长链非编码RNA可显著降低膀胱癌的发病率[18]。白血病是一种恶性肿瘤，EZH2基因的过表达在白血病的产生中起到关键的作用。Xie H等[19]通过CRISPR-Cas9技术敲除了白血病模型小鼠的EZH2基因的表达，白血病起始细胞的生长发育得到了明显的抑制。CRISPR-Cas9还可成为癌基因遗传学方面的高通量分析的手段[20]。还可用于癌症相关基因的筛选[21]。CRISPR-Cas9技术逐渐在癌症研究领域发挥重要作用，并有可能成为新的治疗手段。

4.2 对病毒进行基因编辑

CRISPR-Cas9可对多种动物和人类病毒的基因进行编辑，对病毒性疾病的防控和治疗具有重要的意义。Xu A T等[22]采用CRISPR-Cas9技术对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)基因进行编码，获得高达100%的基因缺失病毒，可作为较好的载体用于疫苗研发。Tang Y D等[23]采用该系统对PRV基因组进行编辑，可阻断病毒的复制，有可能成为一种新的控制PRV的有效手段。目前，人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)尚无有效治疗方法,HIV-1在复制过程中可将病毒基因组整合到宿主细胞中，Ebina H等[24]发现CRISPR-Cas9可以阻断HIV-1长末端重复序列在休眠期和诱导后的T淋巴细胞中表达，可用于清除处于潜伏期感染的HIV-1。Goetze R W等[25]利用该技术,证实了HIV在感染单核细胞THP-1过程中，并不依赖于DNA 聚合酶β。通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，有望通过基因治疗的方法，治疗处于感染期和潜伏期的HIV-1[26-27]。CRISPR-Cas9为病毒性疾病的防控和治疗提供了新的思路和解决方案。

4.3 对细菌进行基因编辑

2013年Jiang W等[28]采用CRISPR-Cas9技术对肺炎链球菌的基因编辑，同时还利用双质粒表达系统对大肠埃希菌进行基因编辑，这是首次报道了CRISPR-Cas9技术可对细菌进行基因编辑。以后的研究表明，CRISPR-Cas9技术可对链霉菌属的多个菌种进行基因编辑[29-31]。CRISPR-Cas9技术有可能在构建新一代工程菌的过程中起到关键作用[32]。与真核细胞不同的是，细菌很难修复CRISPR造成的损伤。因此，探索CRISPR对细菌的致死机制有助于研发新一代的抗菌药物[33]。

5 小结与展望

CRISPR-Cas9技术是一项新的基因编辑技术，在真核生物和原核生物得到了广泛的应用，显示出了强大的基因编辑能力。但是，由于受到sgRNA识别位点特异性的限制和某些物种基因结构的复杂性，在应用CRISPR-Cas9技术的过程中还面临着脱靶的问题，在一定程度上限制了其在基因功能研究方面的应用，需要进一步改进。Zhang F等又发现了新的CRISPR-Cas13系统，可实现更高位点特异性的切割，并可对RNA进行切割，弥补了CRISPR-Cas9技术不能直接对RNA进行识别和编辑的不足[34-35]。随着CRISPR-Cas9系统的不断改进和优化以及新的Cas系统的出现，其应用范围将更加广泛，在基因功能的研究和应用上发挥更大的作用，并可能成为治疗和防控人类及动物疾病的一项新技术。