唑来膦酸对乳腺癌小鼠的抑瘤作用
2018-04-17郭庆军刘运江
杨 超 李 林 郭庆军 刘运江
(河北医科大学第四医院乳腺中心，河北 石家庄 050011)
1石家庄市人民医院乳腺科2河北医科大学教务处
乳腺癌致死原因主要为复发及转移。采用化疗辅助治疗乳腺癌可将亚临床微小转移灶有效杀灭，减少复发率、死亡率，乳腺癌骨转移发生率亦较高，而对于骨转移的治疗主要有介入、药物治疗或放疗。唑来膦酸是目前治疗骨转移比较常用的药物，效果显著。有研究表明，唑来膦酸同时具有抗骨转移和抗肿瘤效果〔1〕。本研究对4T1皮下移植瘤小鼠给予唑来膦酸联合多西他赛治疗，观察其抑制肿瘤疗效。
1 材料和方法
1.1材料4T1鼠系乳腺癌细胞株、多西他赛注射液(国药准字H20052068，深圳万乐药业)；注射用唑来膦酸(注册证号 H20140218，Novartis Pharma Schweiz AG)；IRDye 800CW EGF探针(美国LICOR公司)。
1.2试验方法选取对数生长期4T1细胞混悬液，将其在BALB/c小鼠右腋乳垫区进行接种，单只肿瘤细胞混悬液剂量为0.1 ml(1×106个)。1 w后可触及皮下肿瘤时证明已完成小鼠肿瘤模型种植，肿瘤体积为150～200 mm3时将其随机分组。随机将32只小鼠随机平分为A、B、C、D组，其中A组作为对照，于小鼠腹腔注射0.2 ml生理盐水；B组采用唑来膦酸注射，与每只小鼠皮下注射5 μg唑来膦酸；C组采用多西他赛注射，每只小鼠腹腔注射15 mg/kg多西他赛；D组采用唑来膦酸和多西他赛联合注射，首先腹腔注射15 mg/kg多西他赛，然后在同一只小鼠皮下注射5 μg唑来膦酸，以上4组均每周注射2次，共3 w。
1.3观察指标
1.3.1小鼠肿瘤重量、抑瘤率的测定计算肿瘤形成时，每3 d采用电子天平测量单只鼠重量，将小鼠处死后彻底剥离瘤体，然后称肿瘤重量和抑瘤率。B、C、D组抑瘤率分别为(A组肿瘤平均值-本组肿瘤重量平均值)/A组肿瘤平均值×100%。唑来膦酸和多西他赛联合用药对4T1乳腺癌细胞株抑制效果评估根据金正均Q值法〔8〕，即Q=E(a+b)/(Ea+Eb-Ea×Eb)，其中Ea为唑来膦酸对肿瘤抑制率，Eb为多西他赛对肿瘤抑制率，E(a+b)联合用药对肿瘤抑制率。当0.85
1.3.2小鼠活体移植瘤荧光成像注射药物后1 d，将EGF探针通过小鼠尾静脉进行注入，然后对小鼠体内肿瘤细胞进行标记，在下肢肌肉通过选用氯胺酮注射麻醉小鼠，起效且满意后把小鼠放入成像仪内并固定，在成功标记后的10 min、24 h、48 h、72 h进行成像，然后对小鼠进行瘤体、脏器解剖。
1.3.3瘤体细胞凋亡率测定取解剖后流体边缘新鲜组织，将其置于70%酒精内24 h，然后将其取出并制作成单细胞悬液，通过应用流式细胞仪检测细胞凋亡比例。
1.3.4小鼠转移灶计数及脏器组织病理观察对小鼠的脏器和瘤体进行解剖，若观察发现有肺脏转移病灶时先行生理盐水清洗，然后在显微镜下记录肺脏表面转移灶数量，将瘤体和除肺脏以外的其他脏器放入10%中性甲醛溶液中，制成石蜡块。石蜡切片，HE染色肝、肺脏、脊柱和肿瘤，显微镜观察其组织病理状态。
1.4统计学方法采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、LSD检验。
2 结 果
2.1各组肿瘤体积、肿瘤重量及抑瘤率比较4组荷瘤小鼠经处理后肿瘤体积增大缓慢，D组及C组肿瘤体积显著小于A组(P<0.05)、B组肿瘤体积略小于A组，但差异无统计学意义(P>0.05)，D组肿瘤体积明显小于C组(P=0.011)，见表1。将小鼠处死并剥离完整肿瘤进行重量测定，B、C、D组抑制瘤率的Q值均>1.15。B组与A组肿瘤重量差异无统计学意义(P>0.05)；C组、D组肿瘤重量明显小于B组，D组明显小于C组(P<0.05)，C组(26.5%)、D组(34.9%)抑瘤率明显大于A组(5.2%，P<0.05)，D组抑瘤率明显大于C组(P<0.05)，按照Q值>1.15可判定D组联合用药具有显著协同作用。
表1 各组肿瘤体积、肿瘤重量比较
与A组比较：1)P<0.05，与B组比较：2)P<0.05，与C组比较：3)P<0.05
2.2各组活体移植瘤荧光成像C组、D组的肿瘤荧光密度平均值(3.12±0.28，2.11±0.23)明显小于A组(6.61±0.22，P<0.05)，B组肿瘤荧光密度平均值(6.32±0.39)略小于A组，但差异无统计学意义(P>0.05)，D组肿瘤荧光密度平均值显著小于C组(P<0.05)，见图1。
2.3各组移植瘤细胞凋亡率及肺脏转移灶数量比较D组细胞凋亡率〔(19.15±0.87)%〕显著高于A、B、C组〔(10.38±0.74)%、(11.21±0.45)%、(13.23±0.62)%，P<0.05〕；B组、C组细胞凋亡率略高于A组，但差异无统计学意义(P>0.05)。C组、D组转移灶数量(17.13，7.38)显著小于A组、B组(40.38，36.12，P<0.05)。B组与A组差异无统计学意义(P>0.05)。
2.4各组脏器组织病理学观察解剖小鼠后可见双肺转移，未发现腹腔腹水及肝、骨转移。HE染色光镜可见A组癌巢境界清晰，肿瘤细胞呈条、索状，细胞核异型明显；B组、C组、D组可见略增大的肿瘤细胞，少数细胞出现固缩、裂解，最终演变为凋亡、坏死的细胞。肿瘤内可见大量炎性细胞浸润和坏死组织，纤维化明显，表明肿瘤生长受抑制，见图2。
图1 各组活体移植瘤荧光成像
图2 各组脏器组织病理学观察
3 讨 论
唑来膦酸对肿瘤引发的骨转移具有显著的治疗效果，有资料表明，唑来膦酸较2代双膦酸盐药物比较具有起效快、缓解率高、持续缓解时间长等优点〔2〕。本研究显示，唑来膦酸对代谢性骨病具有明显的治疗效果，其抗肿瘤作用显著，其可在微摩尔浓度下对RhoA进行抑制、使趋化因子受体有所下调、抑制基质金属蛋白酶(MMPs)的侵袭作用〔3〕。唑来膦酸可能通过对MDC1基因mRNA表达进行下调，破坏DNA修复机制，引发细胞凋亡而产生抑瘤效果〔4〕。唑来膦酸可“靶向”作用于骨骼系统，其可首先与骨表面相结合，而对除骨系统以外的软组织肿瘤抗肿瘤能力较低。本研究显示多西他赛和唑来膦酸联合应用具有更为突出的肿瘤抑制作用；与相关临床研究结果相符〔5，6〕。
辅助化疗可将乳腺癌患者体内无法临床识别的微小转移灶及残余病灶进行有效消灭。并且对内脏转移的阻止具有一定的作用。本研究证明多西他赛联合唑来膦酸具有较好的抗肿瘤疗效，对肿瘤细胞的侵袭具有较好的降低或灭活作用，乳腺癌转移过程有所减慢，使小鼠生存无进展期得到延长。
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