铁皮石槲对D-半乳糖致阿尔茨海默病模型小鼠大脑病理的影响

农　嵩　凌霄雁　韦爱伯　邓晓珍　黄炳臣　潘　霖　张子丽　张树球

(右江民族医学院生物化学教研室，广西　百色　533000)

1右江民族医学院附属医院

铁皮石槲是兰科石槲属多年生附生草本植物，主要分布我国西南和江南各省〔1〕，性气平、味甘、淡、归胃肾经，具有益胃生津，滋阴清热的功效。临床可用于慢性胃炎、高血压、糖尿病等症，还具有抗肿瘤、抗衰老等作用。阿尔茨海默病(AD)是老年人常见的疾病，以认知能力迅速减退为特征，实际是快速衰老。本实验利用D-半乳糖加亚硝酸钠给小鼠腹腔注射，建立衰老模型〔2〕；用铁皮石槲提取液灌胃治疗，测定大脑乙酰胆碱酯酶(AchE)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)等指标，同时取大脑行病理检查，观察其抗衰老作用。

1　材料与方法

1.1试剂D-半乳糖、亚硝酸钠、氯化钠、冰醋酸(分析纯，Sigma产品)；AchE、GSH-Px、MDA分别购自四川成都迈克科技有限公司、凯基生物公司、南京建成生物工程研究所。

1.2中药铁皮石槲(干药材)由广西玉林师范学院惠赠。药物称量，放提取锅内，加水，加热提取：提取药液→加乙醇沉淀→过滤去沉淀→回收乙醇→药液定容，分装密封，高压105℃灭菌30 min，取出冷却放冰箱保存。首乌复方(制首乌，龙眼肉等)提取液和金银花复方口服液(金银花，甘草，茯苓等)，制药方法与铁皮石槲相同。

1.3动物小白鼠65只，昆明种，3月龄，健康，雌雄各半，购自右江民族医学院动物室，动物实验许可证：SYXK桂2011-0010，动物生产许可证：SCXK桂2012-0003，购自右江民族医学院动物室标准动物饲料喂养，称体重，分笼喂养，每笼3～5只，编号，雌雄分开，自由饮用自来水，放独立式鼠笼饲养箱内饲养(广东珠海市再鑫仪器有限公司产品)，空气过滤净化，室温空调26℃～28℃。

1.4AD模型建立用1.2%D-半乳糖和1.8%亚硝酸钠水溶二液混合给小鼠腹腔注射〔2〕，1次/d，D半乳糖用生理盐水溶解为1.2%，剂量按120 mg·kg-1·d-1，1.8%亚硝酸钠，剂量按180 mg·kg-1·d-1，实验连续60 d。

1.5动物实验将造模动物分成：铁皮石槲组、首乌复方组、金银花组、模型组，另设正常组，各组13只。铁皮石槲组用铁皮石槲提取液灌胃，剂量按成人(50 kg体重)剂量(10 ml/次，3次/d)折算，以蒸馏水稀释成0.4 ml灌胃，从造模后第25天开始，1次/d；首乌复方组用首乌复方提取液灌胃，剂量方法同前折算；金银花组用金银花复方口服液灌胃，剂量同前折算；正常组用等量生理盐水灌胃；至结束前1 w停药〔3〕。实验期间正常组1只死亡；模型组3只死亡；铁皮石槲组2只死亡；首乌复方组2只死亡；金银花组3只死亡。

1.6生化指标测定实验结束，从小鼠眼球后静脉取血0.8～1.0 ml，离心取血清待用。处死动物，取大脑，用生理盐水洗去血液，并用滤纸吸干水分，称重，在冰浴下用匀浆器匀浆，用生理盐水稀释成10%匀浆，离心(3 500 r/min)10 min，取上清液4℃冰箱保存备用。测定脑匀浆AchE活力、MDA含量、GSH-Px活力〔4〕，具体操作按试剂盒说明书。

1.7大脑病理切片检查采用苏木素-伊红(HE)染色法观察雌鼠脑组织病理，放大倍数200或400倍。

1.8统计学方法采用SPSS13.0软件进行方差分析、LSD检验。

2　结　果

2.1脑匀浆生化指标和蛋白质水平脑AchE：正常组明显低于铁皮石槲组、模型组；GSH-Px：模型组明显低于其他组；MDA：正常组、首乌复方组明显低于其他组(P<0.05,P<0.01)；蛋白质含量：各组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2大脑海马、皮质病理检查结果见图1、图2。正常组：大脑皮质及海马区神经细胞、神经胶质细胞无变性、坏死，组织结构及层次未见显著改变。模型组：大脑皮质和皮质海马区少数神经细胞胞体肿胀、胞质空亮、Nissl体消失、胞核缩小偏位深染，呈急性神经细胞溃变改变，少数神经细胞胞核、胞体收缩，核仁不明显、核与胞质融合固缩，呈慢性进行性神经细胞坏死改变。铁皮石槲组病变程度与模型组基本一致。首乌复方组病变程度比铁皮石槲组轻。金银花病变程度比模型组和铁皮石槲组轻。

表1　各组脑匀浆生化指标和蛋白质含量比较

与正常组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.01；与首乌复方组比较：4)P<0.05

图1　各组大脑海马病理切片检查(HE)

图2　各组大脑皮质病理切片检查(HE)

3　讨　论

AD病理特征主要表现在大脑神经系统，如出现老年斑、神经纤维变性缠结、细胞变性凋亡等，而病变主要分布在大脑海马和皮质部位〔5〕。 海马神经细胞是胆碱能神经中枢分布的部位，医学界大多认为胆碱能神经与记忆功能有关，乙酰胆碱是胆碱能神经的神经递质〔6〕，它以胆碱和乙酰辅酶A为原料，在胆碱乙酰基转移酶(ChAT)催化下合成，在完成了神经传导功能之后，又在AchE催化下分解成乙酸和胆碱，正常情况下合成与分解保持着平衡，以维持乙酰胆碱的正常功能，一旦平衡被打破，胆碱能神经功能就会发生障碍，导致认知能力的改变。本实验结果表明，AD鼠AchE活力明显升高，经治疗有一定降低好转，接近正常，但铁皮石槲治疗未见降低好转，接近AD模型；GSH-Px AD模型明显低于治疗组和正常组，说明经治疗抗氧化能力明显增强；MDA含量，首乌复方组和正常组明显低于其他组，含量最高是模型组，说明其不饱和脂肪酸被氧化分解最强，抗衰老抗氧化能力最差，首乌复方组和正常组抗衰老抗氧化能力最强。

本实验细胞形态学的改变与生化酶学的变化基本一致，铁皮石槲未见明显疗效是否因治疗时间过短或其他原因，有待进一步研究。

1黄志海，黄结丽.HPLC测定石槲夜光颗粒中小檗碱含量〔J〕.中国中药杂志，2005；30(14)：1130.

2何胜，玉莹，陈菊芳，等.用D-半乳糖加亚硝酸钠建立痴呆症小鼠模型和中药治疗的效果〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(2)：422-4.

3张树球，黄秋艳，李朝敢，等.用Y型水迷宫测定锌与海尔福口服液对铅染毒所致小鼠记忆障碍的改善作用〔J〕.中国冶金工业医学杂志，2006；23(5)：546-8.

4叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程〔M〕.第2版.南京：东南大学出版社，1997：2.

5张宝第，郭雄.铝致阿尔茨海默病的分子机制〔J〕.国外医学地理分册，2003；24(1)：57-9.

6官斌，李玉梅，马骏，等.不同工艺制品的补肾中药对痴呆小鼠乙酰胆碱酯酶活性和M-受体功能的影响〔J〕.标记免疫分析与临床，1997；4(3)：152-6.