葡萄籽原花青素对自发性高血压大鼠左室重塑和氧化应激的影响

张先杰　王晓玲　黃霜枝　靳俊峰　吴秀香

(遵义医学院珠海校区病理学与病理生理学教研室，广东　珠海　519090)

1遵义市绥阳县人民医院心内科

目前临床使用的降压药物作用单一，且均有一定的副作用，因此，寻找副作用少、能作用于高血压发病的多个环节，并能改善甚至逆转脏器损伤，特别是左室重塑的理想药物颇为重要。研究发现，压力负荷和氧化应激与高血压左室重塑发生关系密切〔1〕，而前期研究表明，葡萄籽原花青素(GSP)具有抗氧化、降压等作用〔2,3〕，因此推测GSP对左室重塑应具有一定的抑制作用。本实验以自发性高血压引起的左室重塑为模型，观察GSP对高血压左室重塑的抑制作用并从氧化应激方面探讨其机制。

1　材料与方法

1.1材料SPF级雄性8 周龄自发性高血压大鼠(SHR)24 只，同周龄WKY大鼠6 只，体质量(200 ± 20)g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物许可证号：SCXK(京)2012-0001。GSP(天津尖峰天然产物研究开发有限公司惠赠，纯度≥95%)；卡托普利(中美上海施贵宝制药有限公司)；p47phox(Santa Cruz公司)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ⅱ抗(Abcam公司)；血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及羟自由基(OH·)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2方法

1.2.1动物分组与给药24 只SHR随机分为4组：SHR组、GSP低和高剂量组及卡托普利组，每组6 只；6 只WKY大鼠为对照组。治疗组大鼠每日灌胃给药1 次，分别为：GSP 50 mg·kg-1·d-1和200 mg·kg-1·d-1；卡托普利 30 mg·kg-1·d-1；对照组及SHR组给予等量蒸馏水灌胃。每次灌胃量2 ml，连续灌胃8 w。

1.2.2大鼠尾动脉收缩压(SBP)测定采用Tail-cuff测压法，用大鼠无创尾动脉压测定装置、多通道生理信号采集处理系统(RM6420，成都仪器厂)进行动态检测，每周测压1次。

1.2.3全心指数和心室指数测定灌胃治疗8 w后，称量大鼠体重，6%水合氯醛(0.5 ml/kg)麻醉大鼠，开胸且迅速摘取心脏，于预冷的生理盐水(4℃)中冲洗，滤纸吸干，称重。于4℃下去除左右心房、右心室和大血管等组织，保留完整的左心室(包括室间隔)，滤纸吸干后称量其质量，分别计算全心质量指数(HW/BW)和左室质量指数(LVW/BW)。

1.2.4病理学指标观察在心脏左室中部沿横轴切取0.5 cm厚的心肌组织，4%多聚甲醛溶液中固定，行HE染色和Masson染色，显微镜下观察心肌细胞形态、大小及心肌间质胶原分布情况并使用Digilab2-s软件拍照(×400)，每个切片中随机选取80个左心室心肌细胞横切面，应用图像分析软件Image-Pro Plus6.0测量其横截面积，取平均值作为该大鼠的心肌细胞横截面积(CSA)。同样方法测量并计算心肌间质胶原容积分数(CVF)，CVF=心肌间质胶原面积/所测视野面积。

1.2.5心肌组织中SOD、MDA和抑制OH·能力的测定将冻存大鼠心肌组织制成10%的组织匀浆液，4℃、12 000 r/min离心5 min后取上清液，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.6总蛋白的提取和Western印迹检测p47phox蛋白表达大鼠左室心肌制成10%组织匀浆液，加入等体积的2×上样缓冲液，煮沸10 min使蛋白变性，12 000 r/min 4℃离心5 min，取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法测定样品的蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转印至硝酸纤维素膜上，封闭、洗膜后与其特定的稀释过的一抗4℃孵育过夜，洗膜后加二抗37℃摇床孵育45 min，洗膜，显色，压片、曝光、显影、定影于胶片。胶片拍照后，用Image J软件进行灰度值分析，以实验各组吸光蛋白条带平均值与同一样品中内参条带的平均值比值作为蛋白的相对含量。

1.3统计学分析采用SPSS17.0软件行单因素方差分析及LSD-t检验。

2　结　果

2.1GSP对SHR SBP的影响灌胃治疗8 w后，与对照组相比，SHR组大鼠尾动脉SBP升高显著(P<0.01)；与SHR组相比，3个治疗组大鼠尾动脉SBP均明显降低(P<0.01)，见表1。

2.2GSP对SHR HW/BW和LVW/BW的影响经灌胃给药8 w后，与对照组相比，SHR组大鼠的HW/BW和LVW/BW明显升高(P<0.01)。与SHR组相比，3个治疗组均使上述指标降低，以GSP高剂量组和卡托普利组效果明显(P<0.01)，且二组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.3GSP对SHR心肌细胞形态和CSA的影响SHR组心肌细胞肥大，胞质肿胀，心肌细胞间质增多，CSA明显增大，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。3个治疗组大鼠的上述情况均有所减轻，以GSP高剂量组和卡托普利组效果显著(P<0.01)，见图1和表2。

表1　GSP对SHR尾动脉SBP、HW/BW和LVW/BW的影响

与对照组比较：1)P<0.01；与SHR组比较：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

图1　各组心肌细胞形态变化(HE，×400)

组别CSA(μm2)CVF(%)对照组45398±1817270±022SHR组69892±17171)469±0291)GSP低剂量组67732±16422)436±0272)GSP高剂量组46084±17463)317±0263)卡托普利组45815±17553)295±0223)

2.4GSP对SHR心肌胶原纤维分布和CVF的影响Masson染色将心肌胶原纤维染成蓝色。对照组大鼠心肌肌间隙较窄，心肌细胞之间可见少量胶原纤维。SHR组大鼠心肌肌间隙明显增宽，肌间隙胶原纤维显著增多，呈栅栏样排列。3个治疗组的肌间隙胶原积聚均有所减少，排列较规则。其中，以GSP高剂量组效果较为显著，见图2和表2。

图2　各组心肌间质胶原纤维变化(Masson染色，×400)

2.5GSP对SHR心肌组织MDA含量、SOD活性和抑制OH·能力的影响给药8 w后，SHR组心肌组织MDA含量增高显著(P<0.01)，而SOD活力和抑制OH·能力显著降低(P<0.01)；3个治疗组心肌组织MDA含量均降低，SOD活力以及抑制OH·能力均升高，以GSP高剂量组和卡托普利组效果显著(P<0.01)，且二者相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3　GSP对SHR心肌组织中MDA含量、SOD活性和抑制OH·能力的影响

2.6GSP对SHR心肌组织p47phox蛋白表达的影响SHR心肌组织p47phox蛋白表达(1.75±0.07)较对照组明显增多(0.96±0.08，P<0.01)，与SHR组相比，GSP低、高剂量组和夫托普利组心肌组织p47phox蛋白表达均显著降低(1.52±0.06，1.16±0.07，1.09±0.08)，以GSP高剂量组和卡托普利组降低显著(P<0.01)，见图3。

1：对照组；2：SHR组；3：GSP低剂量组；4：GSP高剂量组；5：卡托普利组图3　各组心肌组织p47phox蛋白表达

3　讨　论

长期高血压会导致左室重塑，变化主要包括左室肥大与心肌间质纤维化，前者主要表现为左室心肌细胞体积变大，重量增加，后者主要表现为间质中胶原纤维积聚增多〔1〕。本研究结果表明SHR左室发生了重塑，模型成功建立，GSP具有缓解SHR左室重塑作用。研究证实，持续的压力负荷增大即机械因素是导致左室重塑的原因之一〔4,5〕，其机制是通过离子通道和细胞形变转导等机制启动细胞内信号转导通道诱发核内基因的重排和活化，导致心肌蛋白合成增加，使心肌细胞肥大、间质纤维化，即发生左室重塑〔1〕。因此，可通

过降低血管压力而减轻压力负荷，从而缓解左室重塑。关于GSP的降压作用，国内外报道较少，意大利学者报道〔6〕，GSP能使轻度高血压患者血压显著降低，对心血管疾病有保护作用。本实验结果显示，GSP能使SHR尾动脉尤以高剂量GSP治疗组效果显著，与我们先前的研究结果一致〔2,3〕，表明GSP可以通过降压而减轻压力负荷来缓解高血压的左室重塑。氧化应激在引起左室重塑的多种病因中发挥重要作用〔7〕。氧化应激是持续的高浓度的自由基(主要包括活性氧等)与抗氧化系统失衡所致。NADPH 氧化酶是细胞内活性氧最主要来源〔8〕，p47phox是此酶的4个亚单位之一，在心肌细胞表达。有学者在压力负荷诱导的心肌肥大和心力衰竭的豚鼠模型上发现p47phox转位于心肌细胞膜增多，其依赖性的活性氧产生显著增加〔9〕。活性氧通过刺激转化生长因子(TGF)-β1分泌和心肌纤维母细胞增殖及胶原合成，最终导致左室重塑〔10〕。本实验结果显示，GSP可通过对抗自由基的生成，增强机体抗氧化能力而发挥降压及缓解高血压左室重塑的作用。

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