运动对增龄性大鼠骨骼肌TGF-β/Smad信号通路的作用

虎　力　温佩彤　高　原　张伟波　徐　平　

(上海中医药大学针灸推拿学院，上海　201203)

衰老性肌萎缩(SA)，也称增龄性骨骼肌萎缩，伴有骨骼肌质量及力量下降，增加摔倒、骨折风险，危害老年人健康〔1〕。研究表明〔2〕，衰老骨骼肌卫星细胞的密度及再生能力下降能够延长肌肉损伤的恢复。衰老过程中肌肉卫星干细胞异常分化与纤维化和脂肪沉积有关〔3〕。转化生长因子(TGF)-β是重要的促纤维化形成的细胞因子，对细胞分裂、增殖具有促进或抑制的双重作用〔4〕。研究表明，抗阻运动或长时间耐力运动对预防SA有良好效果〔5〕。本研究探讨运动对TGF-β/Smad信号通路的作用。

1　材料与方法

1.1实验动物分组6月龄雄性SD大鼠，36只，体重(420±20)g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，饲养于上海中医药大学实验动物中心(SPF级)。适应性饲养1 w后，将大鼠随机分为18月龄空白(YC)组、18月龄运动(YE)组、20月龄空白(AC)组、20月龄运动(AE)组、22月龄空白(JC)组、22月龄运动(JE)组，每组各6只。

1.2动物模型建立大鼠自6月龄起给予自由饮水和饮食，室温(23±1)℃，相对湿度(50±5)%，光照明、暗各12 h。饲养至12月龄开始跑台运动。实验前各组大鼠反应良好，毛发光滑、色白，行动敏捷。

1.3干预措施空白组：YC、AC、JC组为基础数据对照，不运动，只选择与运动组相同的时间点练习抓取动作。运动组：YE、AE、JE组采取运动干预，各组的运动周期为：YE 12～18个月，AE 12～20个月，JE 12～22个月。参照Bedford等〔6〕的运动方案，起始速度15 m/min，持续2 min×6次，两次运动之间休息2 min，坡度均为0，隔日1次，3 w后休息1 w。

1.4标本取材各组分别于处理因素结束，待大鼠休息24 h后，采用10%的水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉，迅速取比目鱼肌、腓肠肌称重，一部分用锡纸包裹标记后立即置于液氮中，另取一部分置于4%多聚甲醛溶液制备石蜡切片。通过心脏取血采集全血5 ml，常温静置1 h，离心(3 000 r/min)15 min，分离上层血清，用于检测丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)活性。待所有标本收集完成后立即置于-80℃超低温冰箱备用。

1.5指标检测①每天观察各组大鼠的饮食、毛发及精神活动状态，肌肉获取前称量体重，计算肌肉湿重与体重之比。②依据试剂盒说明(南京建成抗氧化检测试剂盒)检测血清SOD、MDA含量。③采用常规石蜡切片，对比目鱼肌进行苏木素-伊红(HE)染色；采用OLYMPUS CX21型光学显微镜观察骨骼肌形态；采用Leica IM50 image manager V1.20分析软件对切片进行抓图、存储与分析。④采用常规Western印迹法检测骨骼肌蛋白表达，包括：与骨骼肌纤维化相关的信号蛋白TGF-β/Smad2/p-Smad2/Smad3/p-Smad3；与骨骼肌降解相关的信号蛋白肌肉萎缩盒F蛋白(Atrogen)/肌肉特异性环指蛋白(MuRF)/肌肉生长抑制素蛋白(MSTN)。

1.6统计学方法应用SPSS16.0软件进行t检验。

2　结　果

2.1行为学观察YC及YE组已出现毛色发黄、脊背部体毛枯疏无光泽，且存在不同程度的脱毛现象，尾部有色素沉着，活动相对减少，反应较为迟钝，但饮食尚积极，AC、AE、JC、JE组上述表现更为明显。

2.2各组体重与湿重及血清SOD、MDA水平比较YE、AE组体重较YC、AC组均有所下降，但比目鱼肌和腓肠肌的湿重及湿重/体重均有所增加，但只有AE组比目鱼肌湿重/体重较AC组差异有统计学意义(P<0.05)。JE组大鼠体重及比目鱼肌、腓肠肌的湿重及湿重/体重均较JC组增加更为明显，但只有JE组腓肠肌湿重较JC组差异有统计学意义(P<0.05)。YE与YC组、AE与AC组比较SOD水平显著升高，MDA水平显著降低(均P<0.05)；JE与JC组比较SOD水平有所增加，MDA水平有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　各组体重湿重及血清SOD、MDA值比较

与YC组比较：1)P<0.05，与AC组比较：2)P<0.05，与JC组比较：3)P<0.05；下表同

2.3各组比目鱼肌形态比较YE组骨骼肌细胞排列整齐，大小均匀，细胞膜清晰，肌纤维排列整齐，YC组部分区域肌纤维排列较松散，肌纤维圆形化、肌细胞直径大小不等，细胞外基质增多；与AC组相比，AE组肌纤维排列较为紧密，圆形化肌纤维和细胞核中心化现象相对少见；JC组大部分区域肌纤维排列较松散，且肌纤维大小、形态差异较大，部分肌纤维边界圆润，出现较多圆形化的肌纤维；JE组肌纤维排列较JC组紧密，圆形化肌纤维和细胞核中心化现象存在。见图1。

图1　各组比目鱼肌横切面图(HE，×400)

2.4各组TGF-β/Smad通路信号蛋白表达情况比较与YC相比，YE组Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3表达均增加，但只有Smad2、Smad3水平差异有统计学意义(P<0.05)。与AC组相比，AE组上述信号蛋白表达均有所下降，但只有Smad2水平差异有统计学意义(P<0.05)。与JC组比较，JE组Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3水平均显著降低(P<0.05)。见图2、表2。

图2　各组TGF-β/Smad通路信号蛋白表达情况

组别Smad2p⁃Smad2Smad3p⁃Smad3YC组0．68±0．280．71±0．060．45±0．090．61±0．12YE组0．99±0．221)0．72±0．120．64±0．161)0．70±0．10AC组0．41±0．280．85±0．270．55±0．130．70±0．20AE组0．25±0．152)0．72±0．300．40±0．140．53±0．14JC组0．81±0．121．11±0．171．06±0．351．86±0．82JE组0．73±0．373)0．89±0．193)0．74±0．533)1．49±0．643)

2.5各组骨髓肌降解相关信号蛋白表达情况比较YE组TGF、MSTN、Atrogen、MuRF水平均较YC组升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。AE组较AC组上述指标均下降，但只有MSTN、Atrogen差异有统计学意义(P<0.05)。JE组上述指标均较JC组显著下降(均P<0.05)。见图3、表3。

图3　各组骨骼肌降解相关信号蛋白表达

组别TGFMSTNAtrogenMuRFYC组0．41±0．180．64±0．010．63±0．330．44±0．16YE组0．61±0．310．71±0．130．80±0．420．65±0．2AC组0．31±0．220．56±0．120．55±0．150．65±0．13AE组0．29±0．250．46±0．090．42±0．212)0．39±0．092)JC组1．26±0．471．70±0．041．26±0．561．41±0．26JE组0．89±0．483)0．96±0．253)0．67±0．193)1．18±0．413)

3　讨　论

SOD是体内清除自由基的重要抗氧化酶，MDA是细胞自由基损伤程度的指标之一〔7〕，本研究提示运动减缓SA与调节机体氧自由基代谢有关。并且运动能够延缓增龄所致的大鼠骨骼肌衰老的进程。

研究表明，衰老过程伴随骨骼肌纤维化加重〔4〕，骨骼肌纤维化的实质是细胞外基质的过度集聚，导致细胞外基质的纤维化从而形成机械屏障，阻碍细胞的迁移和融合，干扰肌纤维的再生〔8〕，而TGF-β是重要的促纤维化形成的细胞因子。研究表明〔9〕，骨骼肌纤维化是骨骼肌慢性疾病和外伤的病理性标志之一，大量的肌纤维化会干扰肌纤维的再生及收缩功能的恢复。MSTN对骨骼肌的发育和再生具有明显的负性调节作用〔10〕，本研究提示运动后期(20～22月龄)能够降低骨骼肌的纤维化。

运动干预前期(12～18月龄)骨骼肌的纤维化相对增加，而运动后期(20～22月龄)骨骼肌纤维化程度又相对降低，并伴有骨骼肌质量的显著增加，可能原因为正常骨骼肌重量的维持需要蛋白合成与降解之间的平衡，肌萎缩最终都会导致蛋白含量的改变，而蛋白质合成减少和(或)分解增加是导致骨骼肌重量减少的重要原因〔11〕。研究表明〔12〕，骨骼肌在萎缩状态下泛素蛋白酶通路被激活。骨骼肌蛋白降解主要包括溶酶体、泛素-蛋白酶体(UPS)和Ca2+依赖性3种途径。其中，UPS途径是生物体最主要的蛋白降解系统，主要由泛素、泛素相关酶和蛋白酶体3部分组成，在多种蛋白质的降解过程中发挥着重要作用，并具有高度的特异性。在肌萎缩时Atrogen-1和MuRF-1蛋白显著激活〔12〕，而Atrogen-l、MuRF-1这两个基因与骨骼肌蛋白降解密切相关，被认为是与骨骼肌蛋白降解有关的特异性基因〔12〕。研究表明〔13〕，被动运动能够明显降低失神经骨骼肌萎缩中MuRF-1蛋白和mRNA表达水平。耐力训练和抗阻训练后，大鼠腓肠肌MuRF-1、Atrogen和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3 mRNA表达显著降低〔14〕。由此推断，运动减缓SA的进程，可能与运动干预后期降低骨骼肌纤维化和(或)降低骨骼肌蛋白降解有关。

综上所述，本研究从骨骼肌纤维化及骨骼肌蛋白降解的角度，探讨了运动减缓不同月龄增龄性SD大鼠骨骼肌萎缩的作用及其分子机制，认为运动能够减缓SA的进程，其机制可能与运动后期降低骨骼肌的纤维化和(或)减少骨骼肌蛋白降解有关。

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