耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药基因分析

刘宇豪，陈　晨，次仁曲珍，周俊英，3　(.武汉大学，武汉　43007；

2.西藏山南妇幼保健院，西藏山南　856000；3.武汉大学中南医院，武汉　430071)

由于抗生素的不合理使用，细菌对抗生素的耐药率越来越高，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)检出率也逐年递增，CRE耐药机制非常复杂，已在世界范围内引起广泛关注[1，2]。本研究通过对中南医院CRE耐药菌株分布及耐药基因的分析，为CRE的感染控制提供依据。

1　材料和方法

1.1菌株来源收集2015～2017年武汉大学中南医院检验科保存的53株CRE。

1.2主要试剂Taq酶(美国Fermentas公司)，dNTP(湖北晶茂生物技术公司)，DNA Marker 100bp(广州东盛生物科技)，6×Loading Buffer(大连TaKaRa公司)，细菌基因组DNA小量提取试剂盒(北京庄盟公司)，Goldview核酸染料(北京赛百盛生物工程公司)。

1.3PCR引物合成KPC，IMP，OXA-48，VIM和NDM 5种引物由北京擎科公司合成，引物系列见表1。

表1

检测碳青霉烯酶基因所用的PCR引物

注：*Y=C or T。

1.4PCR反应条件blaKPC及blaIMP的反应条件为：94℃预变性10 min，94℃变性30 s，55℃ 退火40 s，72℃延伸50 s，共36个循环，最后72℃5 min。blaOXA，blaVIM及blaNDM的反应条件为：94℃预变性10 min；94℃30 s，58℃40 s，72℃50 s，36个循环，72℃延伸5 min。

1.5药敏试验按梅里埃药敏卡AST-13说明书进行。

1.6CRE表型删选实验采用改良Hodge试验。

1.7CRE菌株基因组DNA提取按照试剂说明书进行。

1.8PCR扩增体系总体积为25 μl，包含DNA模板2 μl，MgCl225 mmol/L 2.5 μl，dNTP(10 mmol/L)0.5 μl，上、下引物各为1 μl，10×PCR缓冲液2.5 μl，DNA聚合酶(5 U/μl)1 μl，双蒸水14.5 μl。

1.9耐药性分析采用WHONET5.6软件进行统计学分析。

2　结果

2.1CRE菌株的分布53株CRE菌株中，肺炎克雷伯菌34株占64.15%，大肠埃希菌12株占22.64%，阴沟肠杆菌7株占13.21%；科室分布为重症监护病房15株CRE占28.30%，呼吸内科病房9株占16.98%，干部病房6株占11.32%，其余科室23株占43.40%；标本类型为尿液标本20株CRE占37.74%，痰液16株占30.19%，引流液9株占16.98%，伤口分泌物4株占7.55%，血液2株占3.77%，脑脊液2株占3.77%。

2.2CRE的耐药率2016年送检标本中，检出肺炎克雷伯菌811株，CRE 69株，检出率为8.51%；大肠埃希菌1 581株，CRE 33株，检出率为2.09%；阴沟肠杆菌225株，CRE 15株，检出率为6.67%。耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌耐药情况见图1，图2。

图1　肺炎克雷伯菌耐药率(%)

图2　大肠埃希菌耐药率(%)

2.3亚胺培南、美罗培南和厄他培南3种药敏纸片的改良Hodge试验53株CRE菌株中，改良Hodge试验阳性株有31株，占58.49%。其中亚胺培南、美罗培南和厄他培南3种药敏纸片的Hodge试验结果一致，见图3。

2.4CRE菌株耐药相关基因扩增结果31株CRE中，携带blaKPC(798bp)基因有29株，检出率96.67%，携带blaNDM (621bp)基因有9株，检出率29.03%，同时扩增出blaKPC和blaNDM基因有8株，检出率25.81%，未扩增出blaIMP，blaOXA，blaVIM基因，见图4，图5。

图3　改良Hodge试验结果示意图

图4　blaKPC电泳结果示意图

图5　blaNDM基因型电泳结果示意图

3讨论药敏结果显示，CRE对碳青霉烯类、头孢菌素类、氨曲南和氟喹诺酮类等抗菌药物耐药率较高，对庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、复方新诺明、替加环素等抗菌药物耐药率较低。治疗CRE感染时，建议临床优先考虑替加环素，或替加环素与氨基糖苷类抗生素联合使用。

改良Hodge试验是CLSI推荐检测碳青霉烯酶表型的筛查方法，本实验53株CRE中，Hodge试验阳性31株，其阳性菌株少的原因可能与某些菌株产碳青霉烯酶量较低有关[3]。Hodge试验采用亚胺培南、美罗培南和厄他培南3种药敏纸片，其试验结果一致，但观察结果发现：厄他培南和美罗培南矢状箭头较为明显，亚胺培南不及它们明显，因此建议Hodge试验时，首选厄他培南或美罗培南纸片。

在药物选择压力下，CRE携带耐药基因的质粒、转座子等可发生水平传播[4]，抗菌药物选择压力不仅能使耐药基因广泛传播，而且会促进耐药基因通过突变、插入序列等方式，使自身基因发生变化，进而使耐药性发生改变，引起耐药基因的传播[5]。本研究中发现1株不常见耐药基因型，推测该菌株可能携带一种新的耐碳青霉烯酶基因，因此建议扩大耐药基因检测范围，或者测序进一步确认该菌株的基因型。31株耐药基因分析中，CRE基因型主要是KPC，其次是NDM，这与目前国内及世界范围内，肠杆菌科细菌携带碳青霉烯酶基因为KPC-2和NDM-1一致[6]。重症医学科和呼吸内科病房检出的CRE主要是肺炎克雷伯菌，耐药基因型主要是KPC型，干部病房CRE主要是大肠埃希菌，耐药基因型主要是KPC和NDM的混合型。医院应重点加强对这些科室CRE的监管力度，严格控制临床医生合理使用抗生素，特别是碳青霉烯类药物的用药指征，防止CRE区域性传播。

参考文献：

[1]Yong D，Toleman MA，Giske CG，et al．Characterization of a new Metallo-beta-lactamase gene，bla(NDM-1)，and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure inKlebsiellapneumoniaesequence type 14 from India[J]．Antimicrob Agents Chemother，2009，53(12)：5046-5054．

[2]张芳芳，王晓丽，瞿洪平，等．肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的主要类型和流行病学分析[J]，中国感染与化疗杂志，2014，14(6)：521-525．

Zhang FF，Wang XL，Qu HP，et al．Prevalence and genotypes of carbapenemase-producingEnterobacteriaceae[J]．Chinese Journal of Infection and Chemotherapy，2014，14(6)：521-525．

[3]Amjad A，Mirza I，Abbasis，et al．Modified hodge te-st：A simple and effective test for detection of carbapenemase production[J]．Iran J Microbiol，2011，3(4)：189-193．

[4]Schuurmans JM，Van Hijum SA，Piet JR，et al．Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid betweenE．colistrains[J]．Plasmid，2014，72：1-8．

[5]Jacquier H，Marcade G，Raffoux E，et al．In vivo selection of a complex mutant TEM(CMT) from an inhibitor-resistant TEM(IRT)during ceftazidime therapy[J]．J Antimicrob Chemother，2013，68(12)：2792-2796．

[6]Li H，Zhang J，Liu Y，et al．Molecular characteristics of carbapenemase-producingEnterobacteriaceaein China from 2008 to 2011：predominance of KPC-2 enzyme[J]．Diagn Microbiol Infect Dis，2014，78(1)：63-65．