腰椎间盘突出症患者血清中Caspase-3和Caspase-9活性研究

赵英伦，马　元，莫　森，李东冉，王　军，刘　冲，詹新立

(广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科，南宁　530021)

腰椎间盘退行性病变是腰椎间盘突出症(prolapse of lumbar intervertebral disc，lumbar intervertebral disc hernia)的发病基础，在外力因素作用下，导致椎间盘纤维环破裂，髓核于破裂处突出压迫后方神经，使患者在不同程度上产生腰痛及坐骨神经痛。随着人们工作模式及生活方式的改变，腰椎间盘退行性病变越发趋于年轻化，腰椎间盘突出症患者及潜在患者也逐年增加，而其治疗方法相对局限，主要包括药物保守治疗、康复治疗、手术治疗等，尚不能完全缓解腰椎间盘突出症引起的腰腿痛。因此，寻找新的治疗方法迫在眉睫。早年观点认为，椎间盘退变是一种形态学改变，主要表现为长期反复的外力造成的生物力学失稳。近年来研究发现，细胞凋亡异常在腰椎间盘退变过程中扮演着重要的角色[1]，是腰椎间盘突出症发生发展过程中的重要病因机制，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)家族在细胞凋亡过程中具有核心调控作用，但腰椎间盘突出症患者体内caspase-3和caspase-9活性变化尚未见报道。

1　材料和方法

1.1研究对象选取2014年12月～2016年5月在广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科住院手术治疗的腰椎间盘突出症患者99例，其中单一节段腰椎间盘突出症患者70例(A组)，男∶女=40∶30，平均年龄45.59±1.10岁；多节段腰椎间盘突出症患者(突出节段≥2个)29例(B组)，男∶女=18∶11，平均年龄49.03±1.43岁；同时随机选取我院健康体检者40例作为正常对照组，男∶女=24∶16，平均年龄44.55±1.65岁；于入院次日采集外周静脉血，将分离出的血清存放于-78℃。各组之间年龄无统计学意义(F=0.091，P=0.91)。各组间性别构成比差异无统计学意义(χ2=0.229，P=0.892)。入选标准： A，B组患者须满足CT或MRI诊断仅为腰椎间盘突出症，且不同程度上具有腰腿痛，术后病理回报为退变椎间盘组织，所有患者及正常对照组人群均排除急/慢性炎症、骨折、椎体滑脱、心脏、肝脏、肾脏、结核、肿瘤及内分泌病史，无其他合并症及并发症。

1.2试剂和仪器人半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶caspase-3，9试剂盒(ELISA)购自江苏晶美生物科技有限公司，试剂盒包括：标准品(100 ng/L)1.8 ml、标准品稀释液6 ml，样品稀释液6 ml，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)10 ml，20×浓缩洗涤液25 ml，显色剂A液6ml，显色剂B液6ml，终止液6ml。使用A450nm酶标仪进行检测。

1.3方法采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测各组血清中caspase-3，9浓度。分别设空白孔、标准品孔及待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔中加入不同浓度的标准品50 μl，根据标准品制作A450 nm的标准曲线。然后，在酶标包被板上待测样品孔中先加待测样品50 μl，标准品孔和待测样品孔加入100 μl的HRP，空白孔除外。封膜后于37℃恒温箱温育60 min。洗板5次，加入显色液A，B。37℃避光显色15 min。加入终止液，10 min后立即读取吸光度(A)值。最后根据样品的A值在450nm标准曲线上计算出对应的caspase-3，9浓度。

2结果血清caspase-3，caspase-9浓度在正常对照组、A组和B组呈递增趋势，见表1。A组(q=3.08，3.29，均P<0.05)、B组(q=5.78，4.50，均P<0.05)caspase-3，caspase-9浓度均高于对照组，差异具有统计学意义，且B组高于A组，差异具有统计学意义(q=3.21，3.22，均P<0.05)。

表1

各组血清caspase-3，caspase-9浓度比较

3讨论细胞凋亡是指机体为维持内环境稳定，由多种基因调控的细胞自主性程序性死亡，其意义在于清除体内衰老、感染、变异等异常细胞。正常情况下，细胞增殖应与细胞凋亡同时进行并形成动态平衡，一旦这种平衡被打破，将导致机体内环境失稳，疾病随之而来。目前研究发现细胞凋亡至少受三种通路调控，分别为：线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路。近年来，越来越多的研究表明细胞凋亡在腰椎间盘退变过程中起着至关重要的作用，主要表现为椎间盘内细胞数量减少，细胞密度降低，使得细胞外基质的生成减少，打破了椎间盘基质生成与破坏的动态平衡，最终导致椎间盘退变。目前研究发现，多种凋亡相关因子可参与到椎间盘细胞凋亡途径之中。据报道[2]，凋亡促进因子Fas/FasL可通过线粒体通路及死亡受体通路诱导并加速椎间盘细胞凋亡。此外，还有学者发现，随着椎间盘退变过程中的阶段不同，凋亡途径也有所不同：内质网通路主要参与在椎间盘轻度退变节段，死亡受体通路主要参与椎间盘中度退变阶段，线粒体通路在椎间盘中、重度退变阶段较为重要[2]。

Caspase家族作为细胞凋亡通路中最重要的调控因子，主要分为三类：凋亡执行因子、凋亡起始因子及炎症介导因子。其中caspase-9作为重要的凋亡启动因子，其全长1 924 bp，含有9个内含子和10个外显子，可编码435个氨基酸，位于级联反应的上游，与细胞色素C(CytC)和相关激活因子结合后使得自身活化，后激活下游的caspase家族中凋亡执行因子，启动caspase级联反应，使染色体降解、凋亡小体形成从而引起凋亡[3]。而caspase-3就是caspase级联反应中最重要的凋亡执行因子，该因子以酶原的形式存在，主要分布于胞浆，并不具有生物学功能，只有被上游凋亡启动因子(如caspase-9)激活后才可裂解为活性小体，再重新结合相关蛋白酶而发挥凋亡作用[3]。

本研究结果显示：腰椎间盘退行性病变患者血清caspase-3，9浓度明显高于正常健康者，且血清caspase-3，9浓度与腰椎间盘突出节段的数量呈正比，说明了凋亡因子caspase-3，9参与了腰椎间盘退变的发生或发展。近年来多种基因敲除动物模型和实验显示，抑制caspase-3的表达可显著阻滞体内和体外的细胞凋亡[4]。临床上或许可以利用caspase-3，9为靶点抑制椎间盘细胞凋亡，通过靶向治疗延缓椎间盘退变过程，让那些具有椎间盘手术潜在风险的患者免于手术的苦痛，从根本上预防腰椎间盘退行性病变及腰椎间盘突出症。

综上所述，凋亡促进因子caspase-3，9介导的细胞凋亡在腰椎间盘退变过程中起着重要的作用，是腰椎间盘突出症的病因机制，今后进一步的研究应以caspase-3，9为靶点抑制椎间盘细胞凋亡，同时筛选并建立出更完整的椎间盘相关细胞凋亡因子表达谱，对腰椎间盘退行性病变及腰椎间盘突出症进行靶向免疫治疗必将成为可能。

参考文献：

[1]赵英伦，马元，李东冉，等．凋亡促进因子TFAR19，Apaf-1与腰椎间盘突出症的关系研究[J]．现代检验医学杂志，2017，32(2)：30-32．

Zhao YL，Ma Y，Li DR，et al．Relationship between apoptosis promoting effector molecules TFAR19，Apaf-1 and lubar intervertebral disc protrusion[J]．Journal of Modren Laboratory Medicine，2017，32(2)：30-32．

[2]Wang H，Liu H，Zheng ZM，et al．Role of death receptor，mitochondrial and endoplasmic reticulum pathways in different stages of degenerative human lumbar disc[J]．Apoptosis，2011，16(10)：990-1003．

[3]Liu J，Yao Y，Ding H，et al．Oxymatrine triggers apoptosis by regulating Bcl-2 family proteins and activating caspase-3/caspase-9 pathway in human leukemia HL-60 cells[J]．Tumor Biology，2014，35(6)：5409-5415．

[4]Chen MF，Huang SJ，Huang CC，et al．Saikosaponin-d induces cell death through caspase-3-dependent，caspase-3-independent and mitochondrial pathways in mammalian hepatic stellate cells：[J]．BMC Cancer，2016，16(1)：532．