江苏宿迁地区汉族人群DNMT3B基因启动子区-149C>T和-579G>T多态性与食管癌易感性的分析

邱　巍，胡　威，赵建江，陈素梅，刘东声

(宿迁市人民医院检验科，江苏宿迁　223800)

1　材料和方法

1.1研究对象血液样本来源于2016年1月～2017年12月在江苏省宿迁市人民医院肿瘤科接受治疗的食管癌患者246例，其中男性177例，女性69例，平均年龄68.14±8.91岁。对照组为健康体检者样本240例，其中男性158例，女性82例，平均年龄58.51±7.94岁，排除肿瘤及其他全身性疾病。样本均来自江苏宿迁地区汉族人群。本研究由宿迁市人民医院医学伦理委员会批准，参与人员知情同意。

1.2试剂与仪器TIANamp Blood DNA Kit全血基因组提取试剂盒(北京天根生化公司)， TaKaRa Ex Taq PCR试剂盒、内切酶和引物(大连宝生物公司)。T100 PCR仪(美国伯乐公司)，FR980A生物电泳图像分析系统(上海复日科技公司)，DYY-8C电泳仪(北京六一仪器厂)，Centrifuge 5424R离心机(德国Eppendorf公司)。

1.3方法

1.3.1基因组DNA提取：采用TIANamp Blood DNA Kit提取所有样本的全血基因组DNA，使用紫外分光光度计检测全血基因组DNA的质量。

1.3.2基因多态性分析：-149C>T和-579G>T位点的基因型运用PCR-RFLP法检测。-149C>T上游引物为5’-TGCTGTGACAGGCAGAGCAG-3’，下游引物为5’-GGTAGCCGGGAACTCCACGG-3’。-579G>T上游引物为5’-GAGGTCTCATTATGCCTAGG-3’，下游引物为5’-GGGAGCTCACCTTCTAGAAA-3’。PCR反应体系见参考文献[2，3]。-149C>T扩增产物采用TAKARA Blnt I酶切试剂盒体系进行限制性酶切，-579G>T扩增产物使用TAKARA Pvu II酶切试剂盒体系进行限制性酶切。

1.4统计学分析对食管癌组和对照组进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，用SPSS 22.0软件进行统计学分析，用卡方检验进行各基因型频率的比较，Logistic回归模型计算比值比(odds ratio，OR)和95%可信区间(confidence intervals，CI)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1基因分型结果-149C>T PCR扩增产物为380 bp，基因型CT可被Blnt I部分切开，见380，207和173 bp三个片段，基因型TT可被完全切开，见207和173 bp两个片段，见图1。

1：MarkerⅠ；2，3：TT型.207 bp/173 bp；4，5：CT型.380 bp/207 bp/173 bp；6：PCR产物.380 bp。

图1DNMT3B -149C>T扩增产物电泳图

-579G>T PCR扩增产物为225 bp，基因型GT可被Pvu II部分切开，见225，132和93 bp三个片段，基因型TT可被完全切开，见132和93 bp两个片段，基因型GG不能被切开，见225 bp片段，见图2。

1：MarkerⅠ；2：GG型.225 bp；3：GT型.225 bp/132 bp/93 bp；4：TT型.132 bp/93 bp；5：PCR产物.225 bp。

图2DNMT3B -579G>T扩增产物电泳图

2.2基因多态性分布比较经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，各组基因型频率均符合遗传平衡定律，具备群体代表性。在-149C>T位点中，经Logistic回归校正年龄、性别后，基因型TT与CT在食管癌组和对照组中差异无统计学意义(χ2=0.089，P>0.05)。按年龄分组后，≥60岁分组和<60岁分组中TT与CT基因型比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。按性别分组后，在男性和女性分组中基因型比较差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。在-579G>T位点中，经Logistic回归校正年龄、性别后，基因型TT与GT+GG在食管癌组和对照组中差异无统计学意义(χ2=0.649，P>0.05)。按年龄分组后，≥60岁分组和<60岁分组中基因型比较差异均无统计学意义(χ2=0.491～0.876，均P>0.05)。按性别分组后，在男性和女性分组中基因型比较差异均无统计学意义(χ2=0.044～0.646，均P>0.05)，见表2。

3讨论DNA甲基化是被最早发现的表观遗传学修饰，其过程是将一个甲基加到DNA腺嘌呤或胞嘧啶上的修饰过程[4]。基因的激活和失活在个体的发育过程中是非常复杂的过程。基因启动子区CpG岛的甲基化水平可影响肿瘤抑制基因的表达[5]。

DNMT3B -149C>T多态性已在多种肿瘤中报道过，本研究中的食管癌组TT基因型为98.0%，与对照组TT基因型98.3%分布几乎相同，在Zhang等[6]对喉鳞状细胞癌的研究中，喉鳞状细胞癌TT基因型为35.0%，显著高于对照组TT基因型(21%)，在Hu等[7]对胃癌的研究中，胃癌TT基因型为99.2%，对照组TT基因型为98.9%，在Qian等[8]对结直肠癌的研究中，结直肠癌TT基因型为98.9%，对照组TT基因型为97.7%，这表明在汉族人群中-149C>T与食管癌、胃癌和结直肠癌无相关性，而与喉鳞状细胞癌有相关性。DNMT3B -579G>T多态性与肿瘤易感性关系也曾报道过，本研究中食管癌组TT基因型为80.1%，其分布与正常对照组TT基因型77.1%一致，而在Wang等[9]对胃癌的研究中，胃癌TT基因型为80.5%，与对照组TT基因型83.4%无差异，在Qian等[8]对结直肠癌的研究中，结直肠癌TT基因型为90.1%，显著高于对照组TT基因型(81.8%)，表明在汉族人群中-579G>T与食管癌和胃癌无相关性，而与结直肠癌有相关性。这说明在不同的肿瘤中DNMT3B的不同剪切子催化活性有差异。DNMT3B在肿瘤发生过程中的机制还需要进一步阐明。

表1

DNMT3B -149C>T基因型频率分析[n(%)]

注：a，用Fisher确切概率法分析。

表2

DNMT3B-579G>T基因型频率分析[n(%)]

参考文献：

[1]王志刚，吴建新．DNA甲基转移酶分类、功能及其研究进展[J]．遗传，2009，31(9)：903-912．

Wang ZG，Wu JX．DNA methyltransferases： classification，functions and research progress[J]．Hereditas，2009，31(9)：903-912．

[2]Zhang XM，Li S，Zhang QM．DNA methyltransferase 3B -149C/T polymorphism and the risk of laryngeal squamous cell carcinoma： a case-control study[J]．Genetics & Molecular Research，2015，14(4)：12866-12871．

[3]Hernández-sotelo D，García-Aguilar R，Castro-Coronel Y，et al．The 46359CT polymorphism of DNMT3B is associated with the risk of cervical cancer[J]．Molecular Biology Reports，2013，40(7)：4275-4280．

[4]沈双，路则明，金景姬，等．表观遗传学修饰的遗传模式及其研究进展[J]．科学通报，2016，61(36)：3878-3886．

Shen S，Lu ZM，Jin JJ，et al．Genetic modes of epigenetic modification and its research progress[J]．Chin Sci Bull，2016，61(36)：3878-3886．

[5]朱卫华，刘继斌．血浆相关基因甲基化在食管癌复发中的临床价值[J]．现代检验医学杂志，2016，31(4)：93-94，97．

Zhu WH，Liu JB．Clinical significance of promoter hypermethylation of esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) in plasma[J]．J Mod Lab Med，2016，31(4)：93-94，97．

[6]Zhang XM， Li S，Zhang QM．DNA methyltransferase 3B -149C/T polymorphism and the risk of laryngeal squamous cell carcinoma： a case-control study[J]．Genet Mol Res，2015，14(4)：12866-12871．

[7]Hu J，Fan H，Liu D，et al．DNMT3B promoter polymorphism and risk of gastric cancer[J]．Digestive Diseases & Sciences，2010，55(4)：1011-1016．

[8]Bao Q，He B，Pan Y，et al．Genetic variation in the promoter of DNMT3B is associated with the risk of colorectal cancer[J]．International Journal of Colorectal Disease，2011，26(9)：1107-1112．

[9]Wang C，Jia Z，Cao D，et al．Polymorphism of DNA methyltransferase 3B and association with development and prognosis in gastric cancer[J]．PLoS One，2015，10(8)：e0134059．