深圳地区人群B群链球菌血清学分布和毒力基因及耐药性分析

江　凡，王飞玲，路瑞静，周喜友，邹建话

(深圳市宝安区妇幼保健院检验科，广东深圳　518101)

B族链球菌(group BStreptococcus，GBS)是一种寄生于人类下消化道和泌尿生殖道的细菌，在成年女性的阴道和直肠中带菌率可达15%～40%，是围产期感染的首要病原菌之一。研究表明，孕妇GBS感染易发生胎膜早破、羊膜腔感染、晚期流产、早产及产褥感染等。新生儿GBS感染最常表现为肺炎和败血症，部分早发型(出生6天内)新生儿可表现为脑膜炎，病死率高达10%，由宫内垂直感染所致；晚发型(生后7～30天)主要表现为脑膜炎和菌血症，发病率和病死率约2%～6%，由出生后水平传播感染所致，约50%的晚发型感染遗留不同程度的后遗症，包括癫痫、脑积水、听力丧失和语言发育迟缓等[1，2]。

GBS血清型与疾病的严重程度和疫苗的设计密切相关。目前已发现10种GBS荚膜多糖血清型：Ⅰa，Ⅰb，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ，Ⅷ和Ⅸ型。分子分型技术对流行病学研究较血清学分型具有更强的鉴别能力[2]。因为这些菌株一般含有需要的基因[3]。GBS有许多毒力因子和毒素，有助于GBS进入宿主细胞，其中包括表面蛋白、毒素和水解酶。C5a肽酶(SCPB)、Laminin结合蛋白(Lmb)、C蛋白的alpha和beta亚单位(Bca和Bac)和Rib蛋白。目前对GBS的流行病学研究、药物敏感的评估和血清学分型在国内开展较少，GBS的分子分型和毒力鉴定亦不多见。本研究旨在分析深圳地区GBS的血清型分布、药敏特点和毒力基因的鉴定；了解深圳地区GBS流行病学，为将来GBS疫苗的研制提供参考。

1　材料和方法

1.1研究对象515例GBS纯培养物来自深圳市四家医院门诊和住院患者(其中大部分来自深圳宝安区妇幼保健院)，其中54例(10.5%)来自新生儿，所有患者出现早发疾病(EOD)(<7天)，已知一大半新生儿(64%)有GBS细菌血症；461例分离株(89.5%)来自成人(年龄范围20～87岁)。在未怀孕的成人中(n=215)，GBS分离株常分离于血液(37.3%)、阴道(35%)、伤口和化脓标本(26%)，仅5例来自尿液标本(1.7%)。对于孕妇(n=246)样本中，绝大多数GBS分离株来自阴道标本(90%)，少量标本来自血液、尿液和胎盘(共占10%)。根据临床结果和分离的部位把分离株分成三组：侵袭性(n=108)，来自正常人体的无菌部位；非侵袭性(n=112)来自伤口、皮肤溃疡、气管和胃抽吸物；其它来自阴道拭子和无症状的尿液标本克隆的分离株(n=295)。除了115例标本GBS和其它微生物共存(金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性的葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、克雷伯菌属和非特异性和特异性球菌)，其余均为纯的GBS培养物。菌株的鉴定是基于培养鉴定、G染色、触酶试验和CAMP试验，所有操作参照《临床微生物鉴定手册》。分离株的种特性用玻片凝聚(Murex Diagnostics，UK)和用PCR鉴定cfb基因(编码CAMP因子)进一步证实。所有菌株保存在菌种保存管中，-80℃长期保存，4℃短期保存在5 ml/dl血琼脂糖平板。

1.2研究方法

1.2.1血清分型：用型特异的抗血清乳胶凝聚方法试剂盒(Statens Serum Institute，SSI，Sweden)对上述GBS分离株血清分型(Ⅰa，Ⅰb，Ⅱ～Ⅸ)，操作严格按照试剂盒说明书。不与任何一种抗血清反应的菌株被归类为血清学不能分型(NT)菌株。

1.2.2PCR分型：所有GBS分离株DNA的提取采用细菌DNA提取试剂盒(天根生物有限公司)，DNA的浓度用微量核酸检测仪分析，提取后的DNA用TE缓冲液保存在-80℃冰箱。GBS的基因分型采用常规的PCR反应，所有引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成。GBS参考株A909(type Ⅰa)，H36B(type Ⅰb)，18RS21(type Ⅱ)，M78(type Ⅲ)，CNCTC 1/82(type Ⅳ)，BAA-611(type Ⅴ)，NT6(type Ⅵ)，7271 SSI(type Ⅶ)由深圳市宝安区妇幼保健院吴丽娟博士提供。

1.2.4毒力基因：所有GBS分离株检测7个毒力基因，即scpB，lmb，hylB，cylE，bac，bca和编码C5a多肽酶的rib基因。引物和PCR反应条件参考文献[4～6]。具有上述基因的GBS参考菌株ATCC 13813(cfb)，ATCC BAA-611(rib)，NCTC 11078(bca和bac)，ATCC12403(cylE)，ATCC12386(lmb和scpB)和无乳链球菌4755(hylB)作为阳性对照。

1.3统计学分析结果采用SPSS 21.0进行统计分析；χ2检验独立用于变异之间的关联性。组别之间采取t检验；计数资料以率表示；所有统计检验均使用α=0.05的双侧检验，当P<0.05时被视为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1血清分型(CS)和分子分型(MS)的比较见表1。在515例GBS样本中，能够用血清分型鉴定为Ⅰa，Ⅰb，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ和Ⅸ血清型的共有470例，占80.6%，45例(8.7%)分离株不能被分型，占8.7%。515例GBS分离株全部能够被分子分型(MS)进行分型，MS可检测所有GBS衣壳血清型基因。在血清分型不能鉴定的45例分离株中，15例分离株为血清型Ⅲ，而其余的30例分离株为血清型Ia。分子方法分型结果显示，血清型Ⅲ是最常见的荚膜型(56.5%)，然后依次为Ⅰb(17.5%)，Ⅰa(12.6%)，Ⅴ(7.4%)，Ⅱ(2.7%)，Ⅵ(1.4%)，Ⅳ(1.0%)和Ⅸ(1.0%)。血清分型和分子分型的结果详见表1。在本研究中没有检测到血清型Ⅶ和Ⅷ的分离株。

表1

GBS样本血清分型和分子分型

针对不同人群特征，我们对Ⅰa，Ⅰb，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ和Ⅸ血清型八种基因型进行了分类，分别为侵袭性、非侵袭性及定植株。不同血清型在侵袭性人群、非侵袭性人群及定植人群中表达不同，Ⅲ型为主要血清型，分别为65.7%，42.0%和58.6%。除Ⅲ型外，在侵袭性和非侵袭性感染人群中，血清型Ⅰa也较为常见(11.1%和29.5%)，Ⅰb在定植人群中较为常见(19.3%)。详见表2。

表2

GBS人群的分子分型分布[n(%)]

2.2药敏试验515例GBS样本药敏试验结果显示：所有GBS分离株对青霉素、氨苄青霉素、头孢呋辛、头孢曲松和万古霉素敏感。E试验证实了GBS对青霉素100%敏感，MIC范围为0.023～0.064 μg/ml。多数分离株(n=443，86.0%)对四环素耐药；345例分离株(67.0%)对红霉素耐药；319例(61.9%)对克林霉素耐药，其中319例克林霉素耐药的分离株中有15例显示为可诱导性克林霉素耐药分离株。

2.3毒力基因四种主要的毒力基因编码β-溶血素/细胞裂解素(β-H/C)、层黏结合蛋白、C5a多肽酶和透明质酸裂解酶(cylE，lmb，scpB和hylB)。几乎所有的GBS分离株中可以检测到cylE，lmb，scpB和hylB基因，检出率分别为97.1%，97.1%，96.1%和94.2%。另外三个毒力基因型(bac，bca，rib)的分布和各种血清型关系见表3。

表3

275例GBS分离株衣壳血清

3讨论本研究是针对深圳地区人群B群链球菌血清型分布、毒力基因和耐药性分析的前瞻性研究，国内同类研究报道较少。在本研究中，515例GBS分离株用血清分型和分子分型方法进行分型，并且对其进行药敏分析。血清分型可以对470例标本进行分型，分子分型可以对所有GBS样本进行分型。相当比例分离株不能用常规的血清分型鉴定，我们的实验结果与有关文献报道[7]相一致(8.7%)。血清分型相对经济实惠，操作简单，但存在一定的局限性，不能对所有分离株进行分型；分子分型能准确对所有分离株进行分型，效率高，但经济耗费相对昂贵。

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本研究中，515例深圳地区GBS分离菌株中，共发现8种血清型，其中血清型Ⅲ在GBS分离株中最为多见(56.5%)，其次是血清型Ⅰb(17.5%)和Ⅰa(12.6%)。对分离菌株进行人群分布，发现在不同的人群中，Ⅲ型为主要血清型。除Ⅲ型外，在侵袭性和非侵袭性感染人群中，血清型Ⅰa也较为常见(11.1%和29.5%)，Ⅰb在定植人群中较为常见(19.3%)。本研究中，血清型Ⅳ，Ⅵ和Ⅸ检出数较少，且未发现血清型Ⅶ，Ⅷ，与相关文献[8，11]报道一致。

本研究药敏结果表明，所有GBS分离株对β-内酰胺敏感，没有检测到青霉素耐药或中度耐药的菌株。但有研究者已鉴定到对青霉素敏感性减弱的GBS菌株[7，9]。因此，青霉素是否可作为分娩期预防和治疗GBS的一线药物仍有待于进一步研究。我们的药敏实验结果表明GBS对红霉素和克林霉素的耐药率较高，与相关报道一致[10，15]。因此，对于那些对β-内酰胺酶类抗生素过敏的孕妇，在选用红霉素和克林霉素时，一定要参考相关药敏结果。

在本研究中，275例GBS样本中可以检测到rib基因，bac基因和bca基因，其血清分型分别为Ⅰa，Ⅰb，Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ，Ⅵ和Ⅸ。其中rib基因检出率最高，占总数的54.5%，同欧美类似，但高于在波兰和科威特孕妇中的报道[10]。来自东南亚和欧洲的报道指出rib基因与血清型Ⅰa，Ⅱ和Ⅲ密切相关[12～14]，但在我们的研究中，rib在血清型Ⅲ中表达最高，其次是Ⅰb和Ⅰa，较为相似。此次研究中bca和bac基因主要分布在血清型Ⅲ和Ⅰb中，比例分别为68%，24%和50%，36%。在Meehan等[14]的一个研究中，约50%的血清型Ⅲ分离株含bac基因或bca基因或两种基因同时存在，这与我们的研究结果一致。有研究发现，30～55%血清型Ⅰa的GBS分离株含bca基因[5]，但在我们的研究中Ⅰa血清型分离株含bca基因比例略低(5.3%)。以上这些结果表明毒力基因和GBS的血清分型之间存在相关性，但也存在地理差异与环境影响。

综上所述，分子分型和常规血清分型各有优缺点，但分子分型更有推广价值，GBS分离株对青霉素和头孢类药物敏感，较多分离株对四环素、红霉素和克林霉素耐药。毒力基因与GBS的分型存在一定的相关性，但GBS的毒力和基因之间相互作用有待于进一步研究。另外，本研究不能证明毒力基因和GBS感染患者临床状态之间的相关性。

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