牧乐星对种鸡鸡毒支原体阳性率的防控试验分析＊

2018-04-16陆彦温炎佳牛志强王雨李新国

中国动物保健 2018年12期

陆彦，温炎佳，牛志强，王雨，李新国＊＊

（1.北京农学院动物类国家级实验教学示范中心北京 102206；2.中牧实业股份有限公司北京 100070；3.焦作市农经管理站河南焦作 454002）

牧乐星主要成分为酒石酸泰万菌素，属于大环内酯类动物专用抗生素（图1），该品对支原体有特效。其作用机理主要通过阻碍菌体蛋白质的合成而发挥灭菌作用；对多种革兰氏阳性菌有抗菌活性。鸡毒支原体病也称鸡慢性呼吸道病（Chronic Respiratory Disease，CRD），是由鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）引起的一种接触性、传染性呼吸道疾病，可以通过水平传播和垂直传播，疾病发展缓慢，病程长，有的呈隐性感染，临床上以咳嗽、流鼻涕、呼吸发出啰音、窦部肿胀、呼吸困难或张口呼吸等为特征长期在鸡群中蔓延。鸡毒支原体感染发病率极高，几乎100%的鸡场都有此病发生，鸡群最高感染率达83.4%，可造成幼雏淘汰率上升和成年母鸡产蛋率下降，是造成养鸡业严重经济损失的疾病之一。

对于这种疫病，目前国内外多以抗菌药物治疗为主。牧乐星（主要成分泰万菌素）具有高效、低毒、低残留等优点，并且不会产生大环内酯类抗生素之间的交叉耐药，是一种较好的治疗呼吸道和消化道感染的大环内酯类抗生素。有文献报道，以推荐剂量口服给药后，泰万菌素在猪体内能够被快速吸收，在鸡体内约1h 达到血浆峰浓度，能够快速地分布到主要器官，其中胆汁、脾脏、肺脏、肾脏和肝脏中的浓度最高；泰万菌素代谢较快，30min内约有50%的原药被代谢，主要代谢物为3-O-acetyltylosin（3-AT）；泰万菌素在猪体内排泄较快，主要的消除途径为粪便排出，给药后72h，使用HPLC 方法检测，泰万菌素的含量已低于10%。汪明等对泰万菌素可溶性粉剂在鸡毒支原体上的疗效展开研究，试验结果表明泰万菌素对用鸡毒支原体诱发鸡呼吸道疾病有良好的预防和治疗作用，当饮水给药浓度达到125μg/m L 时，预防组和治疗组均能明显减少感染鸡的失重，大幅度降低气囊的病理损伤，提高感染鸡的存活率，当治疗组饮水给药浓度达到250μg/m L 时，己完全不见气囊损伤,对照组中泰乐菌素饮水浓度达500μg/m L 时才表现出一定控制鸡呼吸道症状疗效，该试验表明泰万菌素对鸡源鸡毒支原体有极好的疗效。本试验采用ELISA 方法测定草种鸡鸡毒支原体的抗体，通过草种鸡血清中支原体抗体水平变化和支原体抗体阳性率来评价牧乐星药物对鸡毒支原体控制情况。从试验设计和原理上分析，牧乐星对支原体有很强的杀灭作用，结果对牧乐星药物治疗草种鸡鸡毒支原体有一定的参考价值。

1 试验材料及方法

1.1 试验药物

牧乐星（25%），由内蒙古中牧生物药业有限公司提供。

1.2 试验动物及分组

某私人种鸡场，117 日龄草种鸡，2 栋同日龄鸡舍，3,000 只/栋，一栋作为试验组，另一栋作为对照组（表1）。

1.3 血清样品的采集

对照组与试验组同时分别于给药前、停药第1d（给药7d 后）、停药第7d（给药14d 后）、停药第14d（给药21d 后）、停药第21d（给药28d 后），共5 批各组随机抽取30 只草种鸡（母鸡），经翅静脉采血2mL/只，于4℃冷藏析出血清后分离至离心管，血清冻存待检。

1.4 试验材料及设备

M G 抗原（E L I S A）：Biostone Animal Health LLC；MG 标准阳性血清：中国兽医药品监察所，批号：201101；MG 标准阴性血清：中国兽医药品监察所，批号：207401；试验仪器：待检血清，酶标板，移液器，采血管，离心管，枪头等；酶标仪：BIORED-680；生化培养箱：BSP-150

1.5 检测方法

1.5.1 试剂盒采用间接ELISA方法在酶标板微孔上预包被鸡毒支原体抗原。在试验中，加入稀释后的待检血清，经过温育后，若样品中含有鸡毒支原体特异性抗体，则与包被板上的抗原结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后再加入酶标二抗，与检测板上的抗原抗体复合物发生特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶结合物；在微孔中加入TMB 底物液，经酶催化形成蓝色产物，加入终止液终止反应后，用酶标仪450nm 波长测定反应孔中的吸光度值。显色深度与样品中的抗体含量成正相关。

1.5.2 试剂盒规格及组分

图1 泰万菌素化学结构式

表1 试验分组

表2 ELISA 检测试剂组分

1.5.3 数据分析与结果判定判定标准：显色深度（OD 值）与标准阳性血清稀释倍数成正相关，相关系数为99.78%，因此采用样品的OD 值大小表示样品血清中鸡毒支原体抗体水平的高低；根据样品OD 值，样品血清与阴性血清吸光度值之比P/N 值≥2 判定为阳性，计算不同批次的鸡毒支原体抗体阳性率。经ELISA 方法检测给药前测试组与对照组OD 值差异较小，表明给药前测试组与对照组来源场所鸡毒支原体抗体水平基本一致，具备对照参考的依据，下一步进行给药后的样品测试。

2 试验结果

2.1 各个采样点对照组与试验组检测结果

在试验过程中OD 值偏高，体现出样品的抗体水平比较高，其结果采用各组30 个样品OD 总值进行比较分析。结果见表3 和图2，以上结果表明，停药后第1d 与停药后第7d 试验组相比对照组鸡毒支原体抗体水平下降明显；停药后第14d 试验组相比对照组鸡毒支原体抗体水平略有下降，但不明显；停药后第21d 试验组相比对照组鸡毒支原体抗体水平恢复没有明显的变化。表明给药后鸡毒支原体抗体水平先降低后逐渐恢复，反映出药物对鸡毒支原体的控制在停药后第14d 后由强转弱。

2.2 试验组给药前后抗体水平及阳性率分析

为了重复验证上述试验结果的准确性，在上述试验OD 值过高的基础上，降低了包被原的浓度（从200X 降至2000X），降低了样品浓度（由200X 降至800X），对试验组各组血清又进行了同批试验（表4）。

为了更直观地看到给药前后五批样品OD 值和阳性率的变化（表5），将数据分析做图来表示（图3和图4）。从图3 结果分析后看出，OD 值的曲线呈V 型，就是停药后第1d 到停药后第7d，OD 值在不断降低；停药后第14d 到停药后第21d，OD 值逐步回升。表明给药后鸡毒支原体抗体水平在给药前两周在降低，后两周升高趋向于未给药的正常水平。同时验证了前述的纵向对比得出的结果。

图2 试验停药后第1d 到第21d 的变化

表3 对照组与试验组鸡毒支原体抗体水平比较

表4 给药前后试验组样品吸光度值（OD 值）比较

从图4 可以明显看到，给药前后五批样品的抗体阳性率趋势呈U型，变化接近于OD 值曲线的变化，也是前两周在不断降低，后两周恢复至未给药的正常水平，表明药物对鸡毒支原体在前两周有良好的控制率。

3 试验结论

1）给药后测试组样品的鸡毒支原体抗体水平在1～14d 呈现下降状态，15～28d 逐渐恢复至正常水平。

2）给药后测试组样品的鸡毒支原体抗体阳性率与抗体水平趋势表现一致，牧乐星对草种鸡鸡毒支原体抗体阳性率在给药后两周表现出明显的抑制，从第三周起鸡毒支原体抗体阳性率逐渐增高。

3）根据本试验草种鸡养殖条件及鸡毒支原体抗体检测结果，建议其用药方法为：按泰万菌素计250ppm 浓度集中饮水给药7d，停药14d，为1 个疗程，如果鸡毒支原体控制无改善，可考虑再给药1个疗程。

4 讨论

本试验采用ELISA 方法测定草种鸡鸡毒支原体的抗体，通过草种鸡血清中支原体抗体水平变化和支原体抗体阳性率来评价牧乐星药物对鸡毒支原体控制情况。从试验设计和原理上分析，牧乐星对支原体有很强的杀灭作用，最好的评价方法是检测鸡的支原体携带情况，由于分离支原体抗原存在技术上和数量上的难度，本试验选择检测支原体抗体水平以及阳性率来间接反映药物的作用。这种评价方法可能会受到抗原水平和抗体水平相关性的影响，有一些滞后性，但本试验得出的结果也能反映出一定的趋势。因此本试验的结果对牧乐星药物治疗草种鸡鸡毒支原体有一定的参考价值。

表5 试验组鸡毒支原体抗体水平与阳性率

图3 试验组抗体水平比较

图4 给药前后样品鸡毒支原体抗体阳性率

试验动物来源于江苏某私人草种鸡场，养殖条件较差，对照组与试验组选择2 栋同日龄且距离相近的鸡舍，3,000 只/栋。采集的血清样品中鸡毒支原体抗体经ELISA 方法检测阳性水平很高，给药前测试组与对照组血清稀释200 倍后阳性率100%，经过血清稀释800 倍后阳性率为60%，表明本试验动物来源场所鸡毒支原体的携带率及血清抗体水平非常高，可能动物饲养环境较差，隔代消毒不完全，造成鸡群与环境中鸡毒支原体的广泛传播与反复感染。

在鸡血的采集和样品保存方面，为了保证待测血清充足，本试验尽量采集2m L 以上的全血，在实验室离心后得到100μL 以上的血清用于检测以及重复验证；但由于运送路途比较远，加上保存时间有点长，每批样品总会有几个血样完全凝固，造成采集血清困难，可能对提取血清的抗体水平会有一定的影响。

本试验的试剂和溶液配制时间不应该过长，比如牛清蛋白溶液时间长了会有絮状沉淀，在封闭完了后可能会难以洗干净而对试验结果造成误差；硫酸浓度不能太高，否则在终止一段时间后测出OD 值偏小，所以终止后应该尽快测出OD 值。