动植物蛋白源协同增强wistar大鼠抗疲劳能力

任广旭,伊素芹,张鸿儒,王靖*

1(农业部食物与营养发展研究所，北京，100081) 2(中国农业科学院双蛋白工程研究中心，北京，100081)3(农业部农产品质量与营养功能风险评估试验室，北京，100081)

过量运动和不规律作息均能造成不同程度的疲劳。运动型疲劳是连续性超负荷运动刺激所引发的一种生理现象[1]。第五届国际运动生化学会将疲劳定义为机体生理过程不能维持其机能在特定水平上或不能维持预定的运动强度。剧烈运动机体需要消耗大量能量物质，细胞从有氧呼吸提供能量转换成无氧酵解供能。随着运动时间和强度的增加，机体产生大量乳酸、内环境酸碱度和渗透压失调，最终导致机体不能有效维持现有的运动强度，出现力竭现象。因此，通过营养补充使机体快速消除疲劳，提高运动能力是当今运动科学、医学和食品科学关注的焦点。大豆蛋白和乳清蛋白均属于优质蛋白质，具有多种生物调节功能[2]。研究揭示以大豆蛋白和牛乳蛋白组成的混合白能够有效促进运动后骨骼肌细胞内氨基酸转运及蛋白合成[3-4]。单一蛋白源以及混合蛋白对运动疲劳的影响目前尚不清楚，本研究将利用wistar大鼠负重游泳模型对此进行分析。

1　材料与方法

1.1　动物与分组

6周龄SPF级雄性wistar大鼠18只，购于北京维通利华实验动物有限公司，实验动物合格证NO.11400700105348、生产许可证号：SCXK(京)2010-0001。采用IVC大鼠饲养系统，12 h光照周期，严格遵守中国动物实用指南。体重202～226 g，随机分为3组：乳清蛋白组、大豆分离蛋白组和双蛋白组。

1.2　动物模型

运动模型采用wistar大鼠一次性力竭游泳模型。将大鼠置于2倍于身长的游泳筒[水温(25±0.5) ℃]中游泳，尾部负重自身体重10%的铅皮，记录大鼠自游泳开始至力竭发生的时间(s)，力竭判断标准为大鼠全身沉入水中10 s后仍不能通过努力返回水面[5-6]。

1.3　主要材料

大豆分离蛋白：采购于山东禹王集团，食品级大豆分离蛋白，干蛋白质含量>90%。乳清蛋白：采购于美国Hilmar，食品级乳清蛋白，干蛋白质含量为94.6%。SPF级维持饲料，购于北京科奥协力饲料有限公司。

1.4　实验设计

实验用wistar大鼠被随机分成3组，并通过耳标进行标记。首先，对所有大鼠进行为期1周的适应性饲喂，第2周检测实验大鼠体重，计算负重游泳所需铅皮重量。每周一进行1次性力竭训练，周二～周五进行2/3力竭时间的普通游泳运动。运动后分别对3组大鼠进行灌胃处理(浓度100 mg/mL，2 mL/只)。连续饲喂6周，第7周(周一)一次性力竭后灌胃，分别在灌胃后第30、60、90、120和150 min采集尾静脉血。

1.5　检测指标

血液生理生化测定：按照实验设计采集完不同时间点的尾静脉血，收集血清检测肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)。肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性测定使用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，并且按照实试剂盒说明书所示程序进行操作。一次性力竭时间测定：第7周记录每只大鼠力竭的时间。

1.6　统计分析

采用SPSS软件进行数据分析，p<0.05为差异就有统计学意义。

2　结果

2.1　大鼠体重变化情况

本实验选择体重均一的SPF级wistar大鼠，每只大鼠每天定量饲喂20 g SPF级大鼠维持饲料，自由饮水。在负重游泳训练后，每组大鼠分别通过灌胃摄入等量的蛋白质(乳清蛋白、大豆分离蛋白和双蛋白)。经过6周的静水游泳训练及蛋白灌胃处理，第7周检测各组大鼠体重。检测结果表明，各蛋白干预组之间大鼠体重没有明显的统计学差异(表1)，乳清蛋白干预组大鼠平均体重为360.83 g，略高于大豆分离蛋白组(平均体重339.83 g)和双蛋白组(平均体重344.50 g)。

表1　wistar大鼠体重变化情况表Table 1　The weight change of wistar rats (n=6，±s)

2.2　双蛋白对大鼠一次性力竭时间的影响

根据第7周3组大鼠体重数值，按照体重10%负重原则计算尾部铅皮重量，分别对每组大鼠进行负重游泳运动。记录每只大鼠达到力竭状态的时间，乳清蛋白组平均力竭时间为88 s，标准差为21.7、大豆分离蛋白组平均力竭时间为99.8 s，标准差为10.7、双蛋白组平均力竭时间为135.8 s标准差为16.2。统计学分析双蛋白组大鼠达到力竭状态的品均时间显著高于乳清蛋白组和大豆分离蛋白组(p<0.05)，乳清蛋白组与大豆分离蛋白组之间平均力竭时间没有统计学差异。

图1　大鼠负重游泳力竭时间Fig.1　The exhaustive swimming time

2.3　双蛋白对运动后大鼠肌酸激酶的影响

肌酸激酶是机体ATP-CP系统代谢的关键酶，它能够催化ATP生产ADP和磷酸肌酸，为细胞提供运动所需的能量[7]。肌酸激酶在运动过程中变化比较敏感，其含量的多少常用于评价运动的强度大小。经过6周的运动饲喂干预实验，第7周每组大鼠进行一次性力竭负重游泳运动，分别在0、30、60、90、120、150 min采集尾静脉血，检测肌酸激酶的含量。运动前(0 min)3组大鼠肌酸激酶本底水平相同没有明显的统计学差异，“运动+蛋白干预”后30、90 min各组肌酸激酶含量明显高于60、120 min。3组之间肌酸激酶变化趋势一致，表明各组大鼠运动强度基本一致(表1)。

2.4　双蛋白对运动后大鼠乳清脱氢酶的影响

乳酸是体内糖原在缺氧条件下氧化分解的代谢产物，乳酸的堆积是导致运动疲劳的物质之一。乳酸脱氢酶广泛存在于机体组织细胞中，能够催化乳酸与丙酮酸之间转换。结果显示，游泳运动前，3组大鼠乳清脱氢酶活性相同没有统计学差异，“运动+蛋白”干预后第30 min双蛋白组乳酸脱氢酶活性明显升高，而乳清蛋白组与大豆分离蛋白组升高趋势一致，显著低于双蛋白组(p<0.05)。随后到第60 min，双蛋白组乳酸脱氢酶活性急剧降低至与其他2组一致水平。从60～150 min 3组大鼠血清乳酸脱氢酶活性没有明显差异，150 min时各组大鼠基本恢复到静息状态(图2)。

表2　wistar大鼠肌酸激酶动态变化情况表Table 2　Analysis of creatine kinase(n=6，±s)

图2　大鼠乳酸脱氢酶活性动态变化Fig.2　The dynamic change of lactic acid dehydrogenase

3　讨论

运动性疲劳不仅仅发生在职业运动员群体之中，当今大学生、都市健身人群及普通上班族中都存在运动性疲劳。导致运动疲劳的机制尚不清楚，学术界目前存在以下几种学说[8]：(1)能量衰竭学说。主要认为在运动过程中机体消耗大量的能量物质，这些物质不能及时得到补充，从而造成疲劳。(2)代谢产物堆积学说。主要认为运动过程中机体从有氧功能转化成无氧酵解，机体产生大量乳酸和氨[9]，造成机体稳态失调。(3)自由基攻击学说。主要认为运动能力消耗伴随大量自由基产生，机体不能及时清除使自由基与生物膜多不饱和脂肪酸发生脂质过氧反应，造成细胞膜流动性和通透性发生改变。如果不能及时消除运动产生的疲劳，容易影响患者身心健康。现存消除运动性疲劳的方法主要有物理疗法和药物疗法，这些疗法都存在一些弊端。以按摩为代表的物理疗法只能短暂缓解运动疲劳，不能长期改变疲劳状态。药物疗法耗时，往往对身体也会产生一些副作用。因此，如何通过饮食缓解运动性疲劳成为食品科学、运动科学和医学领域所关注的焦点。

负重游泳运动模型通常应用在运动营养研究领域[10]。因此，本研究将利用wistar大鼠构建负重游泳运动模型，开展乳清蛋白，大豆蛋白以及混合蛋白的功能评价。研究显示肌肉蛋白的堆积主要发生在运动后的恢复期，因此本研究所涉及的蛋白营养干预都在运动训练完成后，通过灌胃的方式进行[11]。自然膳食参照陈巍两年饲喂试验中wistar大鼠的摄食量[12]，最终确定每只大鼠每天维持饲料为20 g，使得6周运动营养干预期间大鼠日常膳食摄入量保持一致。第7周，通过检测发现所有大鼠体重一致，这种体重的均一除了认为的控制食物的摄入量，还有每周持续性的游泳运动有关，因此研究发现这种运动能够稳定大鼠的体重[13]。前期研究发现按照体重10%计算负重游泳铅皮重量，所达到的效果最好[14]。整个实验采取双盲法，即力竭时间获取由独立的技术人员获取，以保证实验数据的客观性。

通过连续6周的运动营养干预发现，单一蛋白源(乳清蛋白及大豆分离蛋白)干预组的大鼠运动能力，没有明显的统计学差异。而在以动植物混合蛋白干预的大鼠中，发现其平均力竭实现显著地高于单一蛋白源。这一现象可能是由以下几个因素综合作用的结果。首先，大豆与乳清蛋白消化吸收效率不一致。乳清蛋白属于快速降解蛋白[15]，机体在摄入乳清蛋白后30 min内出现高氨基酸血症状[14]。而大豆蛋白的消化效率相比乳清蛋白较慢，前期氨基酸释放较慢，但摄入后能够保持较高水平的氨基酸供给[14，16]。混合蛋白的氨基酸则能够综合两者在氨基酸释放方面的优势，能够保证持续性的氨基酸供给[14]。尤其是支链氨基酸，它在肌肉蛋白质合成过程中发挥着至关重要的作用[17]。其次，乳清蛋白不含有抗氧化物质。大豆蛋白中较多的抗氧化物质[18]。混合蛋白不但能够发挥氨基酸供给优势，而且能够兼顾抗氧化物质。

研究发现持续性的运动能够造成运动疲劳，可以反应在血浆中的酶含量，如乳酸脱氢酶和肌酸激酶[19-20]。通过采集尾静脉血，发现3组不同干预下肌酸激酶的活性变化趋势一致，说明各组运动强基本一致[21]。在相同条件下，双蛋白组营养干预组大鼠平均力竭时间显著长于其他2组。这种差异也体现在血清乳酸脱氢酶活性水平，双蛋白摄入30 min时大鼠外周血乳酸脱氢酶含量最高，60 min后恢复至其他2组一致的水平。说明蛋白组运动营养摄入后30 min内乳酸与丙酮酸之间的转化活动比较频繁。

综上所述，通过连续6周的wistar运动饲喂实验发现运动后摄入动植物混合蛋白能显著提高大鼠负重游泳平均力竭时间，具有显著地抗疲劳功效。本研究结果将为运动疲劳人群制定合理饮食方案提供科学支撑。

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