嗜热脂肪芽孢杆菌木聚糖酶A的H297F定点突变、表达及酶学性质变化

李婵娟，石慧，王曼玥，王婧

1(武汉设计工程学院 食品与生物科技学院，湖北 武汉，430205)2(湖北省农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所，湖北 武汉，430064)

来源于Geobacillusstearothermophilus木聚糖酶最适反应温度在65～80 ℃之间，为高温木聚糖酶，在烘焙、造纸等工业领域具有应用潜力，成为热门研究对象[7]。ZHANG等人应用易错PCR结合family shuffling技术将Geobacillusstearothermophilus木聚糖酶XT6的最适反应温度从77 ℃提高到87 ℃；催化效率也提高了90%[11]。WANG等人对Geobacillusstearothermophilus木聚糖酶XynA的179位H进行饱和突变，当其突变为179F时，催化活性和热稳定性均有提高[12]。本研究采用重叠延伸PCR技术对XynA保守区内可能影响活性的位点H297定点突变为F，以期提高XynA的热稳定性和催化活性。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

菌种和质粒：木聚糖酶基因由本实验室从Geobacillusstearothermophilus菌株中获得并构建成重组质粒pGEX-6p-xynA，可在大肠杆菌中异源表达；大肠杆菌EscherichiacoliDH5α、BL21(DE3)均由本实验室保存。

培养基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，溶于1 000 mL蒸馏水；液体培养基中加入1.5%琼脂粉即为固体培养基。

工具酶和生化试剂：TransStartFastPfuDNA聚合酶为北京全式金生物技术有限公司提供；限制性内切酶BamHI和XhoI、T4 DNA连接酶、DNA 分子量标准和蛋白质分子量标准购自TaKaRa 宝生物工程(大连)有限公司，AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒和AxyPrep Plasmid Miniprep Kit购自爱思进(杭州)技术有限公司，GST-蛋白纯化试剂盒购自GE Healthcare公司(美国)，蛋白质定量检测试剂盒为Beyotime公司产品；桦木木聚糖(birchwood xylan) 、氨苄青霉素、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)购自Sigma 公司(美国)，其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2　仪器与设备

PCR仪，美国Biorad T100 Thermal Cycler；微量离心机，美国Thermo Heraeus Pico 17；超速冷冻离心机，美国Backman OptimeTM LE-80K；凝胶成像系统，中国CLiXN GenoSens1580；细胞破碎仪器，美国Thermo French Cell Press；酶标仪，美国Thermo Multiskan Spectrum。

1.3　方法

1.3.1XynAH297F定点突变

根据嗜热脂肪芽孢杆菌木聚糖酶XynA的核苷酸序列设计引物如下：

TC(下划线为BamHI酶切位点)；

CCAA(下划线为XhoI酶切位点)；

CTTGACCAT(下划线为Phe 297位点)；

GGCAATTCC(下划线为Phe 297位点)；

利用重叠延伸PCR法对xynA的H297位点突变为F。第一步：以构建好的pGEX-6p-xynA质粒为模板，以xynA-F/xynAH297F-R 和xynAH297F-F/xynA-R为引物分别扩增上游片段和下游片段。反应体系为50 μL：5×FastPfubuffer 10 μL，正向引物、反向引物(10 mmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，FastPfuDNA聚合酶(2.5 U/μL)1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，补充ddH2O至50 μL。反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，30个循环。第二步：取上游片段和下游片段混合为模板，以xynA-F/xynA-R为引物进行全长扩增，获得含有酶切位点和突变位点的xynAH297F基因，反应体系同第一步。反应条件为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环。以1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，凝胶回收试剂盒回收DNA片段。

1.3.2重组质粒pGEX-6p-xynAH297F的构建

用BamH I和XhoI对回收后的PCR产物进行双酶切，再回收木聚糖酶基因酶切片段，将其与相应双酶切的pGEX-6p-1质粒载体在4 ℃下酶连过夜，转化E.coliDH5α感受态细胞，构建pGEX-6p-xynAH297F重组质粒，挑选阳性克隆进行测序验证。

1.3.3XynA及XynAH297F在E.coliBL21(DE3)中的表达与纯化

将构建正确的重组质粒pGEX-6p-xynA、pGEX-6p-xynAH297F分别转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中。挑选含有重组质粒的E.coliBL21(DE3)分别液体培养过夜，以1%的接种量分别转接至含100 μg/mL氨苄青霉素2 L的LB液体培养基中，37 ℃摇床培养A600达到0.6～0.7后，加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，18 ℃，200 r/min诱导培养12 h。离心收集菌体，PBS悬浮后高压破碎仪破细胞，12 000 r/min，4 ℃离心30 min，收集细胞破碎液上清，按照谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase，GST)融合蛋白纯化试剂盒说明书纯化重组木聚糖酶XynA及突变体XynAH297F。根据采用5%的浓缩胶和12%的分离胶进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测分析，并根据蛋白定量检测试剂盒说明书测定蛋白浓度。

1.3.4XynA及XynAH297F酶学性质研究

采用Somogyi-Nelson 法测定木聚糖酶活性。取10 μL适量的木聚糖酶加入90 μL缓冲液配制的1%桦木木聚糖底物，一定温度下反应10 min，再加入100 μL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)沸水浴10 min，冷却后加ddH2O定容至1 mL，再取200 μL反应液至96孔板中，酶标仪测定A540读数。

酶活单位定义(Unit)： 在上述条件下，每分钟产生1 μmol木糖所需要的酶量为一个酶活力单位。

1.3.4.1XynA及XynAH297F最适pH及pH稳定性研究

最适pH：配制不同pH值的浓度为1%底物溶液(pH 4～8缓冲液为0.2 mol/LNa2HPO4/0.1 mol/L柠檬酸缓冲液；pH 8.5～10缓冲液为50 mmol/L Gly-NaOH缓冲液)，按照上述酶活测定方法，以最高酶活为100%，计算不同pH条件下的相对酶活。

pH稳定性：将木聚糖酶分别置于不同pH缓冲液中，室温放置20 h后，以最适pH缓冲液配制底物测定活性，以未处理的木聚糖酶酶活为100%，计算相对酶活。

1.3.4.2XynA及XynAH297FP的最适反应温度和热稳定性研究

最适反应温度：以最适pH缓冲液配制底物，按照标准方法测定不同温度下的酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活。

热稳定性：将木聚糖酶分别置于60～80 ℃处理20 min，然后在最适条件下测定酶活，以未处理的木聚糖酶酶活为100%，计算相对酶活。

1.3.5XynA及XynAH297F动力学研究

以最适pH缓冲液配制一系列不同浓度梯度的木聚糖底物，酶促反应结束后，根据Lineweaver-Burk 法，通过双倒数作图，求出米氏常数Km和最大速率Vmax，而催化常数Kcat=Vmax/[E]，[E]为酶浓度。

2　结果与分析

2.1　XynAH297F的定点突变

本实验采用重叠延伸PCR进行xynA的定点突变H297F。如图1所示，以xynA-F/xynAH297F-R和xynAH297F-F/xynA-R为引物分别扩增上游片段891 bp

M-DNA marker；1-引物xynAH297F-F/ xynA-R扩增产物；2-xynAH297F-F/xynA-R扩增产物；3-xynA-F/xynA-R扩增产物图1　重叠延伸PCR扩增xynAH297F基因Fig.1　XynAH297F gene amplified by overlapping extension PCR

和下游片段105 bp，第二轮PCR以xynA-F/xynA-R为引物进行全长扩增所得片段大小为996 bp，与预期一致。构建重组质粒并测序验证，将成功的突变的质粒转入E.coliBL21(DE3)中进行表达与纯化。

2.2　XynA及XynAH297F的诱导表达和纯化

将带有重组质粒pGEX-6p-xynA、 pGEX-6p-xynAH297F的E.coliBL21(DE3)分别诱导表达，破细胞后利用SDS-PAGE检测蛋白表达情况。如图2-A所示，带有空载质粒菌株诱导后只表达了26 ku的GST标签，且主要存在上清中；含有重组的pGEX-6p-xynA和pGEX-6p-xynAH297F菌株均表达了64 ku的融合蛋白，虽然主要存在沉淀中，但是上清中也存在可溶的融合蛋白。经过亲和层析、3C蛋白酶切除GST标签后，最终获得高纯度的木聚糖酶。经SDS-PAGE分析，纯化后的蛋白条带单一，且大小约为38 ku，与预期一致，说明所得蛋白即为目标蛋白。

A-XynA和XynAH297P在BL21(DE3)中的表达分析。M-蛋白质marker；1-IPTG诱导的含pGEX-6p-1的E. coliBL21(DE3)表达上清；2-IPTG诱导的含pGEX-6p-1的E. coli BL21(DE3)表达沉淀；3-IPTG诱导的含pGEX-6p-xynA的E. coliBL21(DE3)表达上清；4-IPTG诱导的含pGEX-6p-xynA的E. coliBL21(DE3)表达沉淀；5-IPTG诱导的含pGEX-6p-xynAH297F的E. coli BL21(DE3)表达上清H297P上清；6-IPTG诱导的含pGEX-6p-xynAH297F的E. coli BL21(DE3)表达上清H297P沉淀。B-M-蛋白质marker；1-纯化后的XynA；2-纯化后的XynAH297P图2　XynA和XynAH297P的表达与纯化SDS-PAGE分析Fig.2　SDS-PAGE analysis of XynA and XynAH297P

2.3　XynA和XynAH297F酶学性质

2.3.1最适反应pH和pH的稳定性研究

如图3-A所示，野生型XynA与突变体XynAH297F的最适反应pH值均为5.5，且在不同pH缓冲液中相对活性几乎相同。由图3-B可知，野生型XynA在pH 4～10的缓冲液中室温处理20h后残余活性均在90%左右；相同处理条件下，XynAH297F残余活性均在95%左右。XynA与突变体XynAH297F均具有较好的pH稳定性，且两者的pH稳定性也几乎相同。说明H297位点对该酶的最适pH和pH稳定性不起关键作用。

A-XynA和XynAH297P的最适反应pH测定; B-XynA和XynAH297P的pH稳定性研究图3　XynA和XynAH297P的最适反应pH及pH稳定性研究Fig.3　The optimum pH and pH stability of the purified XynAand XynAH297P

2.3.2XynA及XynAH297P最适反应温度及热稳定性研究

测定不同温度下XynA和XynAH297F的相对活性，如图4-A所示，XynA的最适反应温度为70 ℃；XynAH297F的最适反应温度为75 ℃，与野生型相比提高了5 ℃。分别测定XynA和XynAH297的热稳定性发现，65 ℃处理20 min后，XynA残余活性降低至80%左右，而XynAH297活性几乎不变；80℃处理20 min后，XynA的残余活性降低至10%左右，而XynAH297仍具有30%左右的残余活性，说明突变体的热稳定性优于野生型。

A-XynA和XynAH297P的最适反应温度；B-XynA和XynAH297P的热稳定性图4　XynA和XynAH297P的最适反应温度及热稳定性研究Fig.4　The optimum temperature and thermal stability of XynAand XynAH297P

2.4　XynA及XynAH297P的动力学参数的测定

以不同浓度的木聚糖为底物，测定XynA和XynAH297P的活性，采用双倒数作图法计算动力学参数。从表1可以看出，与重组野生型酶相比，突变体XynAH297P的Km增大，说明H297位点突变成F后导致酶对底物的亲和力下降。但突变体Vmax和Kcat均增大了1倍，说明突变后酶促催化速率增大，酶活也提高了1倍。

表1　XynA及XynAH297P的动力学参数Table 1　Kinetic parameters for XynA and XynAH297P

2.5　同源建模

Swiss-model 服务器以蛋白质结构数据(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中已经报道的GeobacillusstearothermophilusT6(IXT6; PDB code 3mui)木聚糖酶的三维结构为模板，模拟出突变型酶的三维结构模型。从图5可以看出，Glu44和Asn45是酶与底物结合的关键残基，可能与底物木四糖形成氢键。H297突变为Phe后，底物的空间位置有一定改变，可能影响Glu44和Asn45与底物的作用力，使得酶对底物的亲和力下降。另外，如图5所示，Phe取代His后侧链角度向外偏转，活性空腔变大，可能有利于产物的释放，从而增大酶促反应速率。同时，Phe的苯环结构的疏水性大于His的咪唑基团，有研究表明，引入疏水性氨基酸有利于提高木聚糖酶的热稳定性[13]。李同彪等人对黑曲霉木聚糖酶XynZF-2进行突变引入芳香族氨基酸和其他疏水性氨基酸后都明显改善了XynZF-2的热稳定性、最适反应温度等[14-15]。

蓝色代表突变前酶蛋白结合的底物分子木四糖；黄色代表突变后酶蛋白结合的底物分子；绿色代表his297残基；红色代表突变后的Phe残基图5　利用Siwss-Model 模拟XynA及XynAH297P的结构图Fig.5　The molecular simulation of XynA and XynAH297Pby Siwss-Model

3　结论

本研究利用重叠延伸PCR对嗜热脂肪芽孢杆菌木聚糖酶XynA活性中心附近的H297位点突变为F。在大肠杆菌中异源表达并纯化相关蛋白，比较研究野生型木聚糖酶XynA和突变体XynAH297P的酶学性质发现，H297突变为F后，酶的最适pH和pH稳定性不受影响，但最适反应温度和热稳定性有所提高。F297取代H297后，酶对底物的亲和力下降，但催化反应速率有一定程度提高。本结果为木聚糖酶结构与功能关系研究提供了材料。

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