不同固定液对冷冻组织病理切片HE染色质量对照研究

余燕琪，边庆华

快速病理诊断中，冷冻切片发挥着十分重要的作用，冷冻切片的质量能够直接影响到诊断的快速性和准确性。但是干扰冷冻切片质量的因素较多，其中一项最重要的因素就是冷冻切片的固定液选择，其对冷冻切片的HE染色质量有着十分重要的影响[1]。因此为了选择出最佳的固定液，本次研究针对52例冷冻组织病理切片分别采用了4种不同的固定液进行固定，并对所有切片进行HE染色，查看其染色效果。

1　资料与方法

1.1临床资料选择本院2016年临床科室术中送检的52例新鲜组织参与研究，其中共有36例恶性病变组织，16例良性病变组织，组织来源主要包括甲状腺、乳腺和肺。

1.2方法将新鲜的组织制成切片，切片制作使用的仪器为德国Leica CM1950恒冷切片机。随后准备好实验需要使用的4种固定液，分别是丙酮、95%乙醇、AAF液和改良AAF液。其中AAF液是由15 m1 40%甲醛、80 m1 95%乙醇和5 m1冰醋酸构成，改良AAF液则是由15 m1福尔马林、40 m1 95%乙醇、42 m1苦味酸饱和95%乙醇液、3 m1冰醋酸、0.2 m1 Triton构成。

使用OCT冷冻包埋剂将新鲜的组织块进行包埋，随后放入冷冻切片机，确保组被冷冻至合适的硬度，随后进行组织切片处理，切片厚度为4μm，每个标本需要进行4次切片，以形成4张切片，随后将切片放入4种不同的固定液中，并对切片进行HE染色，染色完成后将切片放置显微镜下进行观察。

2　结果

采用丙酮固定液进行固定的切片，在显微镜下表现出不清晰的组织结构，细胞核存在明显的收缩现象，细胞核和细胞质的染色效果较差，着色不鲜艳；采用95%乙醇固定液进行固定的切片，在显微镜下能够看见较清晰的组织结构，细胞核存在收缩现象，细胞核染色模糊，细胞质染色效果不佳，着色不鲜艳；采用AFF液进行固定的切片，在显微镜下可以看到较为清晰的组织结构，但是细胞核轮廓显示不清晰，细胞核的染色效果较佳，但细胞质染色效果不佳，着色不鲜艳；采用改良AFF液进行固定的切片，在显微镜下可以看到清晰的组织结构，细胞核和细胞质染色效果清晰，颜色鲜艳，两者对比效果明显，见表1。

表1　不同固定液对染色质量的影响比较

3　讨论

冷冻切片是一种快速制片技术，在外科手术和病理科中较为常见，它将病理组织冷冻至一定硬度后再进行切片处理[2]。在外科手术中，借助冷冻切片能够对肿瘤性质和手术切缘进行快速、准确的评估，从而帮助医师快速选择合理的手术方式。因此冷冻切片的质量对病理诊断的准确性和快速性有着决定性的作用。甲状腺、乳腺和肺是最常见的冷冻组织病理切片送检标本，其中甲状腺切片容易出现收缩的现象，细胞核内容易出现白色空泡，从而导致空泡和核内包涵体出现混淆的情况；同时成片肿瘤细胞的细胞质颜色较淡，因此组织结构表现不清晰，观察时容易将其误认成毛玻璃核，在进行HE染色时，若染色较淡，则会难以辨认出乳头轴心，并且对其的冷冻温度应控制在合理范围内，不得过低[3]。肺组织具有丰富的血供和腔隙，可能会存在大量坏死或炎性分泌物的情况，因此在进行冷冻时注意控制冷冻时间，否则可能会出现假象。乳腺组织在制成冷冻切片时，需要保证没有重叠褶皱现象，并确保切片不存在裂隙，使切片保持良好的对比度，并使组织界限能够清晰地展露出来，不得对细胞核过度染色或深层染色[4]。对于导管内乳头状病变组织而言，一般会同时存在大汗腺化生的现象，因此在冷冻切片中，细胞核存在收缩现象，同时伴有深染现象，细胞质的HE染色效果较差，从而对诊断结果产生不利影响。另外，肥胖或乳腺萎缩可能会导致细胞间质中存在较多的脂肪，在此情况下可以适量降低冷冻的温度，从而使切片保持完整，避免出现褶皱或者重叠的现象[5]。

进行组织固定的目的是将组织蛋白质进行变性和凝固，使其沉淀，从而使组织和细胞能够保持原本的形态。冷冻切片质量好坏的重要影响因素之一是切片固定，如果切片固定效果较差，则再进行HE染色时无法得到预期的染色结果[6]。因此本次研究针对冷冻组织病理切片采用了4种不同的固定液进行固定，并对染色质量进行分析对比。其中丙酮和乙醇都是单纯性的固定剂，丙酮具有很强的渗透力，能够使蛋白质完全沉淀，但是对细胞核没有很好的固定效果，着色效果较差，并且使用丙酮后细胞核收缩明显，容易产生脱片情况；乙醇能够将切片上的水分去除，从而使切片的组织结构得以完好的保存下来，并且能够使球蛋白、白蛋白、核蛋白完整沉淀，但是核蛋白的沉淀会在水中溶解，从而使得着色效果不佳，除此之外，乙醇还会形成一层蛋白膜覆盖在组织表面，从而使固定液和染液不能很好地渗入，从而对染色质量产生不良影响[7]。单纯性固定液在进行固定时不可避免存在一定的局限性，通过一定的比例混合后形成复合型固定液，则可以取长补短，提高固定的质量和效果。AFF液和改良AAF液是复合型固定液，AFF液主要是由乙醇、甲醛和冰醋酸构成，冰醋酸具有很强的穿透作用，能够在较短时间内完成组织的固定工作，甲醛不会使组织产生收缩反应，固定效果均匀，但是不能使核蛋白沉淀，通过与乙醇的配合可以有效地进行脱水和协同固定，虽然乙醇对组织细胞具有一定的收缩作用，但是因冷冻产生的细胞内液体膨胀和冰醋酸导致的组织膨胀现象不完全借助乙醇来抑制，因此细胞核易出现肿胀现象，从而使细胞核的染色效果不良[8]。因此在此基础上对AAF液进行了改良工作，加入了苦味酸饱和95%乙醇液和Triton，苦味酸作为一种酸性固定剂，能够对一切蛋白质产生沉淀作用，并且具有明显的收缩效果。苦味酸饱和乙醇具有很强的组织收缩性，能够有效缓解组织膨胀的现象，从而使组织和细胞能够保持原有的形态，也能实现对标本的脱水。Triton X-100是一种离子表面活性剂，能够在短时间内脱去组织和细胞膜中的脂质，从而使细胞膜的通透性得到有效改善，方便固定液能够在短时间内深入细胞质和细胞核，从而提高染色的质量。此次研究中，复合型固定液固定切片的染色效果明显优于单纯性固定液，以改良AAF液的固定效果最佳。

综上所述，固定液的选择对于冷冻切片的染色效果有直接影响，采用改良AAF固定液能够有效地实现对冷冻组织病理切片的固定，能够有效提升染色质量，得到准确的效果，因此值得临床推广。

[1]王晓宇,齐君,孟宪杰,等.不同固定液对冷冻组织病理切片HE染色质量比较[J].中国法医学杂志,2016,31(2):165-167.

[2]周君,谢明,彭茜茜,等.4种固定液对快速冷冻切片的制片效果的影响[J].中国医学工程,2016,24(9):32-33.

[3]冯家成,杨静,张柏辉,等.三种不同固定液和固定方法对脑组织冷冻切片的影响[J].临床与实验病理学杂志,2015,31(5):593-594.

[4]王俊生.探讨HE染色方法在临床病理诊断中的应用价值[J].世界最新医学信息文摘,2016,16(68):144,149.

[5]吴平,张声.无醛固定液与甲醛固定液对组织形态学保存效果比较[J].临床与实验病理学杂志,2015,31(3):343-345.

[6]王晓宇,齐君,孟宪杰,等.不同固定液对冷冻组织病理切片HE染色质量比较[J].中国法医学杂志,2016,31(2):165-167.

[7]董芸蓉.不同固定液对甲状腺冷冻切片固定效果的比较[J].临床与实验病理学杂志,2016,32(6):710-711.

[8]余鑫鑫,袁静萍,阎红琳,等.4种固定液对甲状腺冷冻切片固定效果的比较[J].诊断病理学杂志,2016,23(8):630-631.