优化反应体系提升Phanta DNA聚合酶对非处理标本的检测性能

陈振华，蔡　甜，熊晓辉，许文玲，郭晓博，任顺利，韩锦雄，张海如,4

(1.佛山市南海区人民医院，广东 佛山 528000；2.南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 211800；3.南京诺唯赞生物科技有限公司，江苏 南京 210034； 4.武汉生物工程学院 生命科学与技术学院，湖北 武汉 430415)

20世纪80年代诞生的PCR技术奠定了近代分子生物学发展的基础，然而直到热稳定的DNA聚合酶出现，PCR技术才得以被大规模、高通量应用[1-2]。如今，PCR技术和热稳定DNA聚合酶已被广泛应用于疾病诊断与治疗、传染病检测、药物作用机理、食品检测和法医鉴定等各个领域[3-6]。在多方面的应用中，对DNA聚合酶和PCR技术也提出了更高要求，如更高灵敏度、更低检测下限、更高产量、更高保真度、更快的反应速度、更广的模板兼容范围、对杂质更高的耐受能力、更高GC兼容性以及更低的成本等[7-9]。PCR反应性能一般可从两个方面得以提高，一是使用不同的DNA聚合酶，二是对反应条件进行优化[10-14]。

应用较为广泛的Taq DNA聚合酶具有5′-3′ DNA聚合酶活性和5′-3′ DNA外切酶活性[15]，扩增能力强，但保真度不高。PfuDNA聚合酶分离于Pyrococcusfuriosis菌中，是另一类应用较为广泛的DNA聚合酶[16-17]，具有5′-3′ DNA聚合酶活性和3′-5′ DNA外切酶活性，扩增性能较弱，但保真度较高。Phanta DNA聚合酶是基于PfuDNA聚合酶改造而来的一类DNA聚合酶，保真度和行进性均得到大幅提升，并适用于广泛的模板类型，是食品检测、法医鉴定和疾病诊断等方面的优选用酶。

基于之前对于DNA聚合酶的研究，笔者对Phanta DNA聚合酶的反应条件进行优化，在反应中调节不同的组分以增强聚合酶性能和PCR反应效果，提高对血液、植物和食品等非处理标本的扩增能力。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1DNA聚合酶、添加剂和试剂

Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase、Taq DNA Polymerase、dNTP、DNA Marker/Ladder、质粒提取试剂盒、基因组DNA提取试剂盒、血液基因组提取试剂盒，诺唯赞生物科技有限公司；植物基因组提取试剂盒，天根生化科技有限公司；甘油、二甲基亚砜(DMSO)、二硫苏糖醇(DTT)、MgCl2，Sigma公司；PCR引物由金斯瑞生物科技有限公司合成；其他试剂均为市售分析纯。

1.1.2模板和抑制剂

大肠杆菌DH5α，诺唯赞生物科技有限公司；pEGFP质粒，TaKaRa公司；Hela细胞，保存于诺唯赞生物科技有限公司细胞培养实验室；全血，来自于佛山市南海区人民医院；水稻叶片，南京农业大学赠送；食品(玉米)，来自于超市。

1.1.3培养基和裂解液

液体LB培养基(g/L)：蛋白胨 10，NaCl 10，酵母粉 5。

固体LB培养基(g/L)：蛋白胨 10，NaCl 10，酵母粉 5，琼脂粉 20。

裂解液：20 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L EDTA,0.1% 十二烷基磺酸钠(SDS),pH 8.0。

1.2　方法

1.2.1DNA模板制备

将pEGFP质粒转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有50 μg/mL卡那霉素的固体LB培养基平板上，37 ℃培养过夜，挑取单克隆作为PCR反应模板。

血液基因组、细胞基因组和植物基因组的提取使用提取试剂盒，按照说明书进行提取。

取植物或食品浸泡入100 μL裂解液中，捣碎，加入蛋白酶K至终质量浓度为200 μg/mL。60 ℃加热10 min，然后95 ℃加热10 min。充分混匀，室温离心后取上清即可作为裂解液模板使用。

1.2.2PCR反应

在50 μL PCR反应体系中，加入10 μL Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase配套的5× SF Buffer(含有10 mmol/L MgSO4)，1 μL dNTP Mix (10 mmol/L each)，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL和1 μL Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase。根据不同的试验设计，分别加入不同浓度DMSO和MgCl2以及不同量的模板，用灭菌超纯水补至50 μL。反应条件设置为预变性95 ℃ 5 min；循环反应：变性95 ℃ 30 s；退火60 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 30 s/kb；共35个循环；彻底延伸72 ℃ 10 min。反应结束后通过琼脂糖凝胶电泳、EB染色，观察反应结果。Taq DNA聚合酶的反应体系和程序参照说明书设置。

1.2.3添加剂及浓度优化

选取甘油、DMSO、DTT等3种常用添加剂，测试其对Phanta DNA聚合酶扩增性能的影响[11]。在正常PCR反应体系中，分别加入不同量的甘油、DMSO和DTT，使反应体系中甘油和DMSO的质量分数分别为1%、2.5%、5%、7.5%和10%；DTT的浓度为1、2.5、5、7.5和10 mmol/L。每个反应体系加入50 ng Hela细胞基因组DNA作为模板。反应结束后通过琼脂糖凝胶电泳、EB染色，观察反应结果，确定最适添加剂及浓度。

1.2.4Mg2+浓度优化

在PCR反应体系中，分别加入不同量的MgCl2，使反应体系中Mg2+终浓度分别为2.5、3、3.5、4和5 mmol/L。每个反应体系加入50 ng Hela细胞基因组DNA作为模板。反应结束后通过琼脂糖凝胶电泳、EB染色，观察反应结果，确定最适Mg2+浓度。

1.2.5扩增灵敏度测试

分别使用正常反应体系和加入5% DMSO和3 mmol/L Mg2+(终浓度)的反应体系，加入不同量Hela细胞基因组DNA，使得每个反应中基因组DNA量分别为0.05、0.1、0.5、1、10、25和50 ng，并以Taq DNA聚合酶作为对照。反应结束后通过琼脂糖凝胶电泳、EB染色，观察反应结果，确定可扩增的最低模板起始量。

1.2.6植物粗品扩增测试

分别使用正常反应体系和加入5% DMSO和3 mmol/L Mg2+(终浓度)的反应体系，加入不同植物(水稻、小麦、拟南芥)叶片粗提液进行扩增。并以Taq DNA聚合酶为对照。反应结束后通过琼脂糖凝胶电泳、EB染色，观察反应结果，确定对植物粗品的耐受能力。

1.2.7全血扩增测试

分别使用正常反应体系和加入终质量分数5%的DMSO和3 mmol/L Mg2+(终浓度)的反应体系，加入不同体积(1、5、10、15、20和25 μL)的全血进行扩增，并以Taq DNA聚合酶作为对照。反应结束后通过琼脂糖凝胶电泳、EB染色，观察反应结果，确定可扩增的最高全血体积。

1.2.8食品粗品检测测试

挑取1个含有pEGFP质粒的大肠杆菌单克隆加入到100 μL食品(玉米)裂解液中，涡旋混匀。以混合物为模板，分别使用正常反应体系和加入终质量分数5% DMSO和3 mmol/L Mg2+的反应体系，在体系中加入2、4、6、8和10 μL的混合液进行PCR反应。反应结束后通过琼脂糖凝胶电泳、EB染色，观察反应结果，确定对食品粗品的耐受能力。

2　结果与讨论

在分子诊断、食品检测、法医鉴定等应用中，很多情况需要对样品或样品粗处理品进行直接检测，有时即使提纯的DNA也会含有一些很难去除的杂质。这些杂质中可能含有的PCR抑制剂极有可能会造成检测失败或出现假阴性的结果，影响最终判定[7,18]。这就对耐受杂质、耐受PCR抑制剂的PCR反应体系提出了需求。普通DNA聚合酶对抑制剂耐受性较差，已有报道的和市售的耐抑制的酶有Klentaq、Phanta、Phusion等DNA聚合酶[19]。Klentaq虽有报道对血液具有一定耐受性，但其扩增性能较弱，灵敏度较低[20]；Phanta DNA聚合酶对植物、血液等具有一定耐受能力，并具有高保真性，且保真度优于Phusion，因此，本研究中选用Phanta DNA聚合酶作为备选酶，旨在现有缓冲体系(Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase配套的5× SF Buffer)的基础上，调整添加剂种类和浓度、Mg2+浓度、聚合酶量来进一步优化反应体系，使聚合酶扩增性能进一步提升，得以对植物粗品、血液和食品粗提液进行直接扩增。

2.1　添加剂种类和浓度对反应体系的影响

添加剂种类和浓度对PCR反应有重要影响，一般来说，添加剂的作用主要表现在保护酶、促进解链和退火等几个方面[20-21]。对于不同的聚合酶，所需的最适添加剂种类和浓度均不同，使用相同添加剂对不同聚合酶催化的PCR反应表现出的效果也不尽相同。笔者选取了甘油、DMSO和DTT 3种常见添加剂来优化Phanta DNA聚合酶的扩增性能，结果见图1。由图1可以看出，甘油和DTT对于Phanta DNA聚合酶的扩增性能影响不大，但DMSO可以有效提升Phanta DNA聚合酶的扩增性能，并且在质量分数为5%时效果最佳。

图1　　　　添加剂种类和浓度优化结果Fig.1　　　　Optimization of the additives and their concentrations

2.2　Mg2+浓度对反应体系的影响

Mg2+是DNA聚合酶作用必不可少的金属离子，可有效释放聚合酶活性，但浓度过高也会抑制酶活[14,22]。在PCR反应中，Mg2+还会与dNTP结合，影响PCR反应中游离Mg2+浓度。在不同的PCR反应中，对于Mg2+有不同浓度需求。因此，笔者在添加剂优化基础上，在含有5% DMSO的反应体系中加入不同浓度Mg2+，来寻找Phanta DNA聚合酶的最适Mg2+浓度，结果见图2。由图2可知，Mg2+浓度在3 mmol/L时，Phanta DNA聚合酶具有最高的活性。

图2　　　　Mg2+浓度优化结果Fig.2　　　　Optimization of magnesium ion concentration

2.3　酶量对反应体系的影响

在以上优化添加剂种类、浓度和Mg2+浓度的基础上，笔者对聚合酶使用量也进行了优化。聚合酶在反应体系内使用量在一定范围内可达最优，酶量过低反应效率会降低，酶量过高则会可能引起非特异性扩增或抑制反应进行。在2.2中优化的反应体系中分别加入不同量的聚合酶，结果如图3所示。由图3可知：50 μL体系中，使用1 U的Phanta DNA聚合酶即可达到最优效果，酶量过低扩增效率过低，酶量过高会引起非特异性扩增。

图3　　　　酶量优化结果Fig.3　　　　Optimization of polymerase amount

2.4　优化反应体系有利于提高扩增灵敏度

根据以上实验结果，笔者确定了在5× SF Buffer基础上改进的Phanta DNA聚合酶的优化反应条件，即在5×SF Buffer基础上加入5% DMSO、3 mmol/L Mg2+以及50 μL体系中使用1 U的Phanta DNA聚合酶。在此优化体系的基础上，考察Phanta DNA聚合酶的灵敏度是否得到提升。通过设立模板浓度梯度，考察了优化的反应体系对于反应灵敏度的影响，结果见图4。由图4可知：Taq DNA聚合酶可对1 ng以上基因组模板进行有效扩增，对于0.5 ng基因组扩增效果明显降低。对于未进行反应体系优化的Phanta DNA聚合酶，可对0.5 ng基因组进行有效扩增，而使用优化的反应体系，Phanta DNA聚合酶可对低至0.05 ng基因组进行有效扩增，灵敏度相比普通Taq DNA聚合酶提高10倍。Phanta DNA聚合酶相比于Taq DNA聚合酶，可以更好地结合双链DNA，因此具有较高的灵敏度。

图4　　　　优化的反应条件提高Phanta DNA聚合酶的灵敏度Fig.4　　　　Improved sensitivity of Phanta DNA polymerase with optimized reaction conditions

2.5　优化反应体系有助于提高对植物粗品的耐受度

植物育种过程需要大量鉴定基因型，提取大量植物DNA过程极为繁琐复杂[23-24]，并且植物中含有多糖多酚、蛋白等大量PCR抑制剂[7]，粗品直接进行扩增较为困难。通过在反应体系中加入不同体积的植物粗品作为模板，考察了加入5% DMSO、3 mmol/L Mg2+的优化反应体系中Phanta DNA聚合酶对于植物粗品的耐受程度，各实验均为50μL体系，酶量为1 U，结果见图5。由图5可知：Taq DNA聚合酶对于部分植物如水稻叶片裂解液可以扩增，但产量不高；但对于小麦和玉米等植物叶片裂解液则无法扩增。未优化条件的Phanta DNA聚合酶对于3种植物裂解液均可实现扩增，但扩增效果弱于直接使用DNA进行扩增的对照。经过添加剂、Mg2+以及酶量优化的反应体系中，Phanta DNA聚合酶对3种植物叶片裂解液均可实现有效扩增，扩增效果显著优于未经优化的体系。

图5　　　　植物叶片裂解液直扩结果Fig.5　　　　Electrophoresis of direct PCR with leaf lysis products

2.6　优化反应体系有助于提高对全血的耐受度

全血中含有多种细胞和分泌因子，便于进行有效快捷的医疗诊断[25-27]。同时也由于其中含有血红素、血红蛋白等成分，会抑制PCR反应，对于分子诊断造成一定挑战[19]。通过设置反应中全血使用体积，考察了2.4中确立的优化反应体系中Phanta DNA聚合酶对于全血的耐受程度，结果见图6。由图6可知：Taq DNA聚合酶对于全血几乎无耐受，少量全血即可抑制PCR反应；Phanta DNA聚合酶对全血的耐受显著优于Taq DNA聚合酶，在体系中含有30%全血时，仍可实现扩增；优化反应体系后的Phanta DNA聚合酶在50 μL反应体系中可耐受的全血体积为20 μL，达到总反应体积的40%，相比未优化反应体系时，扩增产量和耐受血液体积显著提高。

图6　　　　优化反应条件有助于提高Phanta DNA 聚合酶对全血的耐受Fig.6　　　　Improved food crude extracts tolerance of Phanta DNA polymerase with optimized reaction conditions

2.7　优化反应体系有助于提高对食物粗品的耐受度

食品安全关系重大，食品中有毒有害微生物的检测是食品安全检测的重要项目[27]。食品中微生物具有含量较低、成分复杂等特点，如使用PCR法进行检测，还需对食品中DNA进行提取[28]。如果能使用粗品进行直接PCR，将大大缩短食品检测的时间。在玉米裂解液中加入少量含pEGFP质粒的大肠杆菌[29]，通过设置反应体系中加入的裂解液体积，考察了同2.4中确立的优化反应体系中Phanta DNA聚合酶对于食品粗品的耐受程度，结果见图7。由图7可知：Taq DNA聚合酶对于食品粗品在超过4μL粗品后即无法扩增；而优化反应体系后的Phanta DNA聚合酶在50 μL反应体系中可对加入的多达8μL的粗品耐受，并可有效扩增其中的微量pEGFP质粒。

图7　　　　食品粗提液直扩结果Fig.7　　　　Electrophoresis of direct PCR with food crude extracts

3　结论

通过使用改良的Phanta DNA聚合酶，并对其反应体系进行优化，发现在SF Buffer中加入5% DMSO、3 mmol/L Mg2+以及50 μL体系中使用1 U聚合酶情况下，Phanta DNA聚合酶具有更优的扩增性能。在此优化条件下，Phanta DNA聚合酶的灵敏度相比Taq DNA聚合酶提高了10倍，并提高了对植物粗品、全血和食品粗品的耐受能力，可对粗品以及粗品中含有的微量微生物进行有效扩增，为植物直扩、分子诊断、食品快检等实际应用提供了原料和技术基础。

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