新型BODIPY类荧光探针及其对食品中Hg2+检测的应用

冷　玲，李　壹，熊晓辉

(南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 211800)

汞是环境中具有很强生理毒性的重金属元素之一，即使在极低浓度下，也会通过消化道、呼吸道和皮肤进入人体内，对神经系统和内分泌系统造成实质性的损害[1-3]。汞中毒和汞污染事件常有报道，相关食品安全问题严重威胁着人们的生命健康。建立一种快速、灵敏、高选择性的食品中Hg2+的检测分析方法具有重要意义。

常见Hg2+的检测方法有冷蒸汽原子吸收光谱法(CVAAS)[4]、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AESS)[5]、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)[6]和电化学法[7]等。尽管这些方法灵敏度高、检出限低，但所需设备昂贵，样品预处理复杂。荧光分析法利用探针与Hg2+发生相互作用，诱导荧光基团结构变化，进而体系产生荧光信号响应。该方法操作简单，成本不高，可对Hg2+选择性识别，实现对样品中Hg2+的裸眼可视化实时监测，所以目前对Hg2+荧光探针的研究备受关注。

氟硼吡咯类(BODIPY)衍生物具有摩尔消光系数较大、紫外吸收峰和荧光发射峰窄、荧光量子产率高、氧化还原电位合适[8-9]、母体对极性和pH的耐受性良好、在生理环境下不易被干扰[10-11]等优点。本文中，笔者将2,4-二甲基-3-乙基吡咯与对甲酰基苯甲酸甲酯在三氟乙酸(TFA)催化下发生缩合、氧化和水解反应，制得新型探针SOH，具体合成路线见图1。基于Hg2+诱导探针发生光致诱导电子转移(PET)的原理，体系表现出荧光由强变弱的现象，从而建立Hg2+的检测方法。根据GB 2762—2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》规定，矿泉水的总汞限量为0.001 mg/L(相当于0.004 985 μmol/L Hg2+)，粮食的总汞限量为0.02 mg/kg(相当于0.099 7 μmol/L Hg2+)，食肉鱼类总汞限量为1.0 mg/kg(相当于4.985 μmol/L Hg2+)。

图1　　　　探针SOH的合成路线Fig.1　　　　Synthetic route of probe SOH

1　材料与方法

1.1　主要原料及试剂

2,4-二甲基-3-乙基吡咯、对甲酰基苯甲酸甲酯、TFA、2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)、三氟化硼乙醚(BF3·OEt2)、磷酸缓冲盐溶液(PBS)，阿拉丁试剂(上海)有限公司；三乙胺(TEA)、NaOH、浓盐酸、甲醇、无水Na2SO4、无水MgSO4，国药集团化学试剂有限公司；二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯、石油醚，西陇化工股份有限公司；硅胶(粒度53～75 μm)，青岛海洋化工厂。

矿泉水、大米和鮟鱇鱼样品购于当地超市。

1.2　主要设备及仪器

ZF-20D型暗箱式紫外分析仪，上海宝山顾村电光仪器厂；78-1型磁力加热搅拌器，上海司乐仪器有限公司；ZNHW-II型精密电子控制仪，杭州大卫科教仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；RF-5301PC型荧光分光光度仪，日本岛津；Cary 60型紫外-可见分光光度计，美国安捷伦公司；1100HPLC/MSD型质谱仪，美国安捷伦公司；BRUKER AM-300/500型核磁共振仪，德国Bruker公司；DZF-6050型真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；AVP2000型高压试验型均质机，丹麦AVP公司。

1.3　探针SOH的合成与表征

化合物SOMe的合成：将2,4-二甲基-3-乙基-吡咯(0.246 g，2 mmol)加入圆底四口烧瓶，再加入100 mL无水二氯甲烷，通Ar，磁力搅拌下加入对甲酰基苯甲酸甲酯(0.164 g，1 mmol)，继续加入1滴TFA，室温下避光反应过夜，淡黄色澄清溶液变为深紫色溶液；薄层层析(TLC)点板监测醛是否反应完全；再加入DDQ(0.227 g，1 mmol)，搅拌1 h，溶液变为深红色；然后加入TEA(2 mL，15.8 mmol)，室温下搅拌10 min；再加入BF3·OEt2溶液(2 mL，15.8 mmol)，搅拌2 h，得反应混合物；将反应混合物用无水Na2SO4饱和溶液洗涤，无水MgSO4干燥，旋蒸去溶剂，得粗产物；将粗产物用硅胶层析纯化，得化合物SOMe(0.171 g，产率:39.02%)。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ∶ 8.17(d,J=8.4 Hz,2H),7.40(d,J=8.4 Hz,2H),3.98(s,3H),2.54(s,6H),2.30(q,4H),1.25(s,6H),0.98(t,6H)；ESI-MS：m/z437.47[M-H]-。

探针SOH的合成：将SOMe溶于50 mL无水甲醇中，加入5 mL 0.2 mol/L NaOH，80 ℃加热回流2 h，旋蒸去溶剂，加入少量DCM，2 mol/L HCl酸化，再加入少量蒸馏水，用二氯甲烷萃取，得化合物SOH(0.066 g,产率:39.87%)。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:8.23(d,J=8.0 Hz,2H),7.45(d,J=8.0 Hz,2H),2.54(s,6H),2.29(q,4H),1.29(s,6H),0.98(t,6H)；ESI-MS：m/z423.47[M-H]-。

1.4　探针SOH的光谱性能测定

1.4.1待测溶液的配制及实际样品的前处理

探针母液：将探针SOH溶解于乙腈中，配制成1.0 mmol/L标准溶液，于4 ℃冰箱中保存备用。测量时，将探针母液用乙腈溶液稀释至所需浓度。

金属离子标准溶液：用分析纯金属盐试剂分别配制Na+、K+、Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+、Cu2+、Cr3+、Cd2+、Ni2+、Co2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+、Ag+和Hg2+储备溶液，再用二次蒸馏水稀释成10.0 mmol/L的标准溶液备用。测量时用乙腈稀释至所需浓度。

矿泉水样品处理[12]：通过0.22 μm微孔滤膜过滤，静置，待用。

大米样品处理[13]：称取大米，加入适量双蒸水，用高压均质机均质10 min，滤纸过滤匀浆以除去残余物，待测大米溶液保存在4 ℃备用。

鮟鱇鱼样品处理[14]：称取1 g鮟鱇鱼肉试样于消解罐中，加入8 mL浓H2SO4，120 ℃加热约1 h，冷却；盖好安全阀，将消解罐放入微波消解仪中，设置最佳条件(5 min由室温爬升到120 ℃，于120 ℃保持3 min，再由120 ℃升温到220 ℃，于220 ℃保持20 min)至消解完全，冷却后将溶液定量转移至小烧杯中，120 ℃加热去酸，将剩余物用PBS缓冲液(pH 7.4)稀释定容至10 mL，混匀，得待测鮟鱇鱼样品溶液。

1.4.2测定方法

在一组10 mL比色管中均加入1 mL探针SOH母液，再分别加入不同量的金属离子标准溶液，用乙腈定容，摇匀并放置4 min。室温下，取3 mL试液于1 cm石英比色皿中测量紫外-可见吸收光谱，做荧光滴定和离子选择性实验，激发和发射波长分别为520和536 nm，狭缝带宽均为5 nm。

2　结果与讨论

2.1　响应时间

向1 μmol/L探针SOH溶液中滴加2倍浓度的Hg2+，观察5 min内探针的荧光响应情况，结果如图2所示。由图2可知：未加入Hg2+时，探针SOH的荧光强度基本不受时间影响；加入Hg2+后，1.5 min内体系的荧光强度逐渐降低，1.5 min后荧光强度趋于恒定，可知探针SOH对Hg2+的响应时间为1.5 min。

图2　　　　探针SOH对Hg2+的荧光响应-时间曲线Fig.2　　　　Fluorescence response of probe SOH to Hg2+ at different time

2.2　探针SOH对Hg2+的选择性

为了考察探针SOH对Hg2+的选择性识别性能，在多种常见金属离子与Hg2+共存时进行干扰试验，结果如图3(a)所示。由图3(a)可知：当在探针SOH的乙腈溶液中加入100倍浓度的碱金属离子(Na+、K+)、100倍浓度的碱土金属离子(Mg2+、Ca2+和Ba2+)和10倍浓度的过渡金属离子(Pb2+、Cu2+、Cr3+、Cd2+、Ni2+、Co2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+和Ag+)后，荧光强度几乎无变化，如图3(b)黑色柱所示。但在上述各溶液中加入Hg2+后，荧光强度明显下降，如图3(b)红色柱所示。图3结果表明，常见的共存离子对识别Hg2+未产生显著干扰。因此，探针SOH可用于混合离子体系中高选择性识别Hg2+，具备在复杂基体条件下的应用潜力。

2.3　探针SOH的镜像实验结果

探针SOH乙腈溶液的紫外可见光吸收光谱图和荧光发射光谱图如图4所示。由图4可知：其吸收峰位于522 nm处，在491 nm处有峰肩，这是常见的含烷基取代基的BOPIPY衍生物所具有的典型特征。一旦探针SOH在520 nm受激发，其最大发射峰出现在536 nm处，探针SOH的荧光光谱图与吸收光谱图显示出镜像对称，与吸收光谱相比，斯托克斯位移14 nm。

图3　　　　纯乙腈体系中向探针SOH加入不同金属离子后的荧光发射光谱(a)和常见金属离子对探针SOH识别Hg2+的影响(b)Fig.3　　　　Fluorescent emission spectra of probe SOH upon addition of different metal ionsin CH3CN(a)and effects of metal ions on recognition of probe SOH to Hg2+(b)

图4　　　　乙腈中探针SOH的紫外可见光 吸收光谱和荧光发射光谱Fig.4　　　　Absorption and emission spectra of probe SOH inCH3CN

2.4　紫外可见滴定和荧光滴定

在探针SOH的乙腈溶液中加入2倍浓度的Hg2+，光谱变化见图5。由图5可知：随着Hg2+浓度增加，522 nm处的紫外吸收峰不断下降，且略有红移。这个新产生的低能吸收带可能是由于Hg2+与苯甲酸的受体单元的选择性作用，导致了荧光团到芳环间的分子内电荷转移。向1 mL探针SOH(5 μmol/L)溶液中滴加10 μmol/L Hg2+时，溶液颜色从黄变红，表明能够实现裸眼识别Hg2+。

图5　　　　乙腈中探针SOH加入不同浓度Hg2+的 紫外吸收光谱Fig.5　　　　Absorption spectra of probe SOH upon addition of different amounts of Hg2+ in CH3CN

向1 mL探针SOH的乙腈溶液(2 μmol/L)中每次滴加10 μL Hg2+(1 μmol/L)，荧光强度减弱，见图6。不同量Hg2+存在下，探针SOH在最大发射波长处的荧光强度标准曲线见图7，根据最低检出限LOD=3s/m[15]，其中s为线性范围内，峰值处荧光强度的标准偏差，m为线性方程的斜率，计算得LOD为0.53 μmol/L。

图6　乙腈中探针SOH加入不同浓度Hg2+的荧光发射光谱(激发波长520 nm，插图：随着Hg2+浓度增加，536 nm处荧光强度的变化)Fig.6　Fluorescence emission spectra of probe SOH upon addition of different amounts of Hg2+ in CH3CN(λex=520 nm,Inset:Fluorescence intensity at 536 nm as a function of Hg2+ concentration)

图7　　　　探针SOH在不同浓度Hg2+下最大发射536 nm 处的荧光强度标准曲线Fig.7　　　　Standard curve of fluorescence intensity at 536 nm of probe SOH and Hg2+ concentration

2.5　探针SOH与Hg2+的配位比

绘制探针SOH与Hg2+的Job-plot工作曲线[16]。固定探针SOH与Hg2+的恒定浓度为20 μmol/L，依次调节探针SOH与Hg2+的浓度比，分别测定探针SOH在522 nm处的吸光度，结果见图8。由图8可知：当探针SOH的摩尔分数为0.5时，吸光度最大，表明探针SOH与Hg2+的配位比为1∶ 1。

图8　　　　乙腈中探针SOH对Hg2+的Job-plot曲线Fig.8　　　　Job-plot of probe SOH for Hg2+ in CH3CN (c(SOH+Hg2+)=20 μmol/L)

2.6　检测原理

由Job-plot实验，结合BODIPY类衍生物的荧光特性和已有的文献报道[17-19]，可推断探针SOH的识别基团未结合底物(Hg2+)时，PET过程受阻，当荧光团被激发后，发射出强荧光；当识别基团结合底物(Hg2+)后，识别基团结构由苯甲酸(—COOH)变为苯甲酸盐(—COO-)，当受到特定波长激发后，处于外层轨道的电子从识别基团的HOMO轨道跃迁到荧光团的HOMO轨道，使得荧光团的HOMO轨道能级升高，同时荧光团的LUMO轨道上的电子跃迁到识别基团的HOMO轨道上，达到稳定状态，无法回到基态，发生了PET效应，从而导致荧光减弱或荧光淬灭，其检测机理见图9。

图9　　　　探针SOH检测Hg2+的机理示意Fig.9　　　　Schematic representation of probe SOH detecting Hg2+

2.7　实际样品检测

以空白样品基质配制一系列不同浓度的Hg2+标准溶液，利用探针SOH进行荧光测定，以Hg2+浓度为横坐标，荧光响应强度为纵坐标，分别得到矿泉水、大米和鮟鱇鱼3种基质的标准曲线及线性方程，见图10和表1。

图10　　　　基质标准曲线Fig.10　　　　Standard curve of mineral water,rice and anglerfish

样品线性方程线性范围/(μmol·L-1)相关系数R2检出限/(μmol·L-1)矿泉水y=404355-48831x1～10099090593大米y=385408-46448x1～10099080598鮟鱇鱼y=364054-45929x1～9098930621

2.8　回收率试验

准确量取1.0 mL矿泉水、大米和鮟鱇鱼空白样品各1份，分别添加3个水平(1、2和5 μmol/L)浓度的Hg2+标准溶液，混匀，再用所建立的方法进行回收率试验。空白样品添加浓度及其回收率见表2。由表2可见，在矿泉水中Hg2+的回收率为97.48%～101.21%，相对偏差为2.10%～3.82%；在大米中Hg2+的回收率为94.36%～98.20%，相对偏差为1.80%～5.64%；在鮟鱇鱼中Hg2+的回收率为105.50%～107.80%，相对偏差为5.50%～7.80%。此结果满足痕量分析的要求，表明了该方法对复杂食品样品中Hg2+进行检测具有可行性和实用性。

表2　实际样品中Hg2+的添加回收率实验

不同基质中Hg2+在相应的浓度范围内线性关系良好，相关系数R2>0.98，可满足定量分析的需要。

3　结论

笔者设计合成了一种BODIPY类荧光探针SOH，通过ESI-MS和1HNMR进行结构确证。实验表明，Hg2+诱导探针发生光致诱导电子转移(PET)效应，体系的荧光由强变弱，溶液颜色由黄色变为红色，在1～13 μmol/L范围内，Hg2+浓度和荧光强度的线性相关系数为0.994，检出限为0.53 μmol/L，从而建立了对Hg2+裸眼可视化和定量检测的方法。本方法成功用于矿泉水、大米和鮟鱇鱼的食品样品Hg2+检测，加标回收率为94.36%～107.80%，相对偏差为1.80%～7.80%，方法可靠，其中对矿泉水和大米中Hg2+最低检出限略高于标准，目前只适用于大批样品的快速筛查和半定量分析，而对鮟鱇鱼中Hg2+最低检出限低于标准，在食品检测方面具有较高的实际应用价值。

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