放射性125I粒子联合塞来昔布对人胃癌裸鼠移植瘤细胞增殖、凋亡的影响及机制

方静，向梅，向桂玲，姚遥

(1青岛大学医学院，山东青岛266003；2荆州市医疗事故技术鉴定办公室；3武汉大学人民医院)

近年来，125I粒子连续低剂量照射因其创伤低、靶向效果佳、并发症少等特点，越来越广泛用于胃癌在内的各种恶性肿瘤治疗[1]。环氧化酶-2(Cox-2)过表达于肺癌、胃癌、宫颈癌等恶性肿瘤，并与疾病预后密切相关，塞来昔布作为Cox-2特异性抑制剂，在肿瘤防治中备受关注。有研究表明，塞来昔布在肺癌、胃癌、宫颈癌等恶性肿瘤的治疗中具有放射增敏作用[2]。本研究应用125I粒子联合塞来昔布治疗人胃癌裸鼠移植瘤模型，观察抑瘤效果和放射增敏作用，并初步探讨相关的抑制机制。

1　材料与方法

1.1材料4～6周龄BALA/c-nu小鼠48只，雌性，体质量16～18 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[合格证号SCXK(京)2014-0004]；人胃癌MKN45细胞购自美国菌种保藏中心(美国ATCC公司)；125I粒子由北京智博高科生物技术有限公司提供；4%多聚甲醛购自北京碧云天生物技术有限公司；RNA提取液购自上海优选生物科技有限公司；cDNA合成试剂盒购自美国Thermo公司；引物由上海生物工程有限公司合成；Ki-67兔抗鼠单克隆抗体购自英国Abcam公司；TUNEL试剂盒购自瑞士罗氏公司；RM2016病理切片机购自上海徕卡仪器有限公司；Nikon DS-U3成像系统购自日本尼康；NanoDrop2000超微量分光光度计购自美国Thermo公司；FBZ2001-up-p标准试剂型纯水仪购自青岛富勒姆科技有限公司。

1.2动物分组及MKN45移植瘤模型构建 取对数期MKN45细胞，调整细胞浓度为1×107/mL，接种于裸鼠左背部近头侧皮下，7 d左右成瘤，待肿瘤长至(300±50)mm3时，将裸鼠随机分为对照组、塞来昔布组、粒子植入组和联合治疗组，每组12只。125I粒子活度为0.6 mCi，固定裸鼠，消毒瘤体及周围皮肤，用穿刺针将粒子置入瘤体中央。对照组和粒子植入组改饮含0.025%Tween-20和0.5%羧甲基纤维素钠的水溶液，塞来昔布组和联合治疗组饮含塞来昔布的溶液[(溶解在 0.025%Tween-20 和0.5%羧甲基纤维素钠的水溶液中，100 mg/(kg·d)]；粒子植入组和联合治疗组置入一枚125I粒子，连续观察30 d，测量移植瘤的最长径和横径，断颈法处死裸鼠，取一小块粒子附近瘤组织放入4%多聚甲醛，固定24 h；余下的瘤组织于液氮保存，粒子全部取出，集中于铅盒，做安全处理。

1.3裸鼠肿瘤体积、抑瘤率测算按公式V=L×W2/2(L:最长径，W:与L相垂直的横径)计算肿瘤体积；抑瘤率(IR)=(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。

1.4各组瘤细胞增殖、凋亡情况观察 按免疫组化SP法对Ki-67进行免疫化学分析；TUNEL法检测细胞凋亡，严格按照说明书操作，对所取瘤组织进行凋亡检测。结果判定：Ki-67阳性细胞主要位于细胞核，为棕黄色或棕褐色染色，每张切片随机选取5个高倍视野(400×)，分别计数阳性细胞数及肿瘤细胞总数。增殖指数(PI)%=阳性细胞数/肿瘤细胞总数×100%；TUENL判定方法与Ki-67相同，凋亡指数(AI) %=凋亡细胞数/肿瘤细胞总数×100%[3]。

1.5肿瘤组织中Caspase-8、Bax mRNA表达测定采用RT-PCR法。反应条件：95 ℃变性15 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40个循环，内参为β-actin，mRNA相对表达量采用2-ΔΔCT法进行分析。引物序列由上海生工生物工程公司设计合成。引物序列：Caspase-8正向引物：5′-TACTCGAGATGGCGGAGTCTTCGGATAA-3′，反向引物：5′-TAGGGCCCTTACCACAGGGAGGTCTTAA-3′，产物234 bp；Bax正向引物：5′-GCCCACCAGCTCTGAGCAGATCAT-3′，反向引物：5′-CGGCAATCATCCTCTGCAGC-3′，产物209 bp；β-actin正向引物：5′-TTCCTTCTTGGGTATGGAAT-3′，反向引物：5′-GAGCAATGATCTTGATCTTC-3′，产物260 bp。

2　结果

表1　　　　治疗30 d时各组裸鼠瘤重、肿瘤体积

注：与对照组比较，aP<0.05；与塞来昔布组比较，bP<0.05；与粒子植入组比较，cP<0.05。

2.2各组肿瘤细胞增殖与凋亡情况比较对照组、塞来昔布组、粒子植入组、联合治疗组PI分别为81.04%±10.12%、77.20%±6.22%、56.20%±8.35%、52.60%±6.03%；对照组、塞来昔布组、粒子植入组、联合治疗组AI分别为62.50%±4.69%、68.80%±5.52%、82.04%±2.58%、86.83%±4.51%。组间两两比较，P均<0.05。

2.3各组肿瘤组织中Caspase-8、Bax mRNA表达量比较对照组、塞来昔布组、粒子植入组、联合治疗组Caspase-8 mRNA表达量依次增多，分别为1、1.38±0.12、1.72±0.35、2.36±0.33；对照组、塞来昔布组、粒子植入组、联合治疗组Bax mRNA表达量同样依次增多，分别为1、2.04±0.22、2.46±0.58%、3.13±0.51。组间两两比较，P均<0.05。

3　讨论

胃癌是消化道常见的恶性肿瘤，发病率高，预后较差。传统放疗在胃癌治疗中占重要地位，然而引起周围正常组织坏死、辐射剂量大等不良反应使其临床应用受限。近年来，近距离放射治疗做为恶性肿瘤的辅助治疗已越来越广泛用于临床，125I粒子是该治疗常用的放射性粒子，在肿瘤组织局部持续低剂量释放射线，最大程度杀伤病灶，而对周围正常组织损伤较小[4]。研究证实塞来昔布在肿瘤治疗中有很好的放射增敏作用，还能发挥抗肿瘤作用[5]。本研究中，我们通过构建人胃癌裸鼠移植瘤模型，探讨125I放射性粒子联合塞来昔布是否能达到放射增敏效应，是否通过调控肿瘤细胞的增殖与凋亡达到目的，以及Caspase-8、Bax基因是否参与调控等。

前列腺素可诱导肿瘤形成、肿瘤微血管生成、遏制肿瘤细胞凋亡，促进炎症反应，而Cox-2抑制剂是花生四烯酸转化为前列腺素的主要限速酶。Cox-2表达在恶性肿瘤生成的早期上调，从而促进肿瘤细胞增殖、血管生成、肿瘤侵袭和转移，与恶性肿瘤预后较差密切相关。Cox-2高表达还与肿瘤对放化疗药物的耐受性有关[6]。近年来，塞来昔布作为一线Cox-2抑制剂与癌症的关系已成为研究热点。塞来昔布是一种非甾体抗炎药(NSAIDs)，与其他NSAIDs一样，能在体内和体外干扰肿瘤的生成或肿瘤细胞生长。左朝晖等[7]通过构建肝癌HepG2裸鼠移植瘤，证实塞来昔布通过抑制Cox-2表达，能显著抑制裸鼠移植瘤的生长和肿瘤微血管形成。相关的体内研究表明，塞来昔布通过下调Survivin表达，抑制人舌鳞癌Tca8113细胞生长，诱导细胞凋亡[8]。这些发现均提示塞来昔布是很有潜力的抗癌药物。梁彩霞等[9]观察塞来昔布对人乳腺癌MCF-7细胞株和宫颈癌HeLa细胞株的放射增敏作用，表明塞来昔布能有效抑制肿瘤细胞对辐射损伤的修复能力，增强放射线的杀伤力。李丽萍等[10]通过回顾分析90例非小细胞肺癌(NSCLC)患者，证实塞来昔布可增加NSCLC患者的放疗敏感性，提高临床疗效、延长患者生存期。

本实验将培养的胃癌MKN45细胞株接种到裸鼠皮下形成移植瘤，125I放射性粒子联合塞来昔布进行治疗，结果显示对照组肿瘤体积和瘤重较另外三组增大，联合治疗组肿瘤体积和瘤重则比塞来昔布组和粒子植入组减少，差异均有统计学意义。对照组肿瘤中央区出现溃破坏死，联合治疗组未见，可能与塞来昔布的抗肿瘤、抗炎作用相关。塞来昔布组、粒子植入组和联合治疗组抑瘤率分别为19.9%、45.3%、61.3%，组间比较差异均有统计学意义，表明125I放射性粒子联合塞来昔布能明显抑制胃癌移植瘤的生长，呈放射增敏效应。

凋亡是一系列形态学变化和生化反应构成的细胞程序性死亡，在免疫系统和自体调节系统等多种生物进程中发挥重要作用。非典型细胞通过凋亡的抑制而存活，显著促进恶性肿瘤生成，使癌细胞特异性生长。凋亡同时亦是放化疗细胞毒性效应之一。Ma等[11]构建NCI-N87胃癌细胞裸鼠移植瘤，采用125I粒子进行干预，结果表明125I粒子能诱导凋亡和细胞周期相关的基因表达上调，同时还抑制移植瘤的生长。大量研究表明，Cox-2抑制剂亦可抑制肿瘤细胞生长并诱导肿瘤细胞凋亡[12]。本研究结果显示，联合治疗组的增殖指数下降、凋亡指数上升，差异有统计学意义。塞来昔布联合125I放射性粒子通过抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡治疗肿瘤，发挥放射增敏效应。

Caspase-8可自我活化，参与细胞凋亡的起始，启动凋亡的细胞内途径。Bax是Bcl-2家族最有代表性的促凋亡基因之一，可在体内拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用。激活的Caspase-8能在胞质中裂解Bcl-2家族成员Bid，与Bax发挥促凋亡作用[13]。钟漓等[14]研究表明，塞来昔布能抑制Bcl-2基因表达、促进Bax基因表达，从而开启线粒体凋亡通路。Liu等[15]研究显示，塞来昔布可下调鼻咽癌HONE-1细胞的Bcl-2基因表达，促进肿瘤细胞凋亡，增加鼻咽癌细胞的放疗敏感性。本研究结果显示联合治疗组的肿瘤组织Caspase-8、Bax mRNA表达量上升，差异有统计学意义。提示125I放射性粒子联合塞来昔布通过上调促凋亡相关基因Caspase-8、Bax表达，抑制肿瘤生长，提高放疗敏感性。

百年大计，质量第一。水利电力工程关系着人民群众的生命财产安全。抓好工程建设质量管理是每一个工程参建单位义不容辞的责任。工程建设项目法人在抓质量上应首先抓好工程项目承建单位的择优选取工作：一是对参标单位进行认真的调研，参标企业实力要与拟招工程项目相适应；二是选择中标单位时以选择拟定进场的项目经理为主要条件；三是商讨合同协议书时，必须注明选定的项目经理在承建工程施工完成前不得更换。

总之，塞来昔布通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡增强患者的125I粒子辐射敏感性，达成更强的抑瘤效果；其促凋亡机制可能与上调促凋亡基因Caspase-8、Bax表达有关。

参考文献：

[1] Tan Q, Qin Q, Yang W, et al. Combination of125I brachytherapy and chemotherapy for unresectable recurrent breast cancer: A retrospective control study [J]. Medicine, 2016,95(44):e5302.

[2] Nurul Akmar M, Laimeng L, Nik Raihan NM, et al. Cyclooxygenase-2 expression in invasive breast carcinomas of no special type and correlation with pathological profiles suggest a role in tumorigenesis rather than cancer progression[J]. Apjcp, 2015,16(4):1553-1558.

[3] Arima N, Nishimura R, Osako T, et al. The importance of tissue handling of surgically removed breast cancer for an accurate assessment of the Ki-67 index[J]. J Clin Pathol, 2016,69(3):255-259.

[4] WPark DS, Gong IH, Choi DK, et al. Radical prostatectomy versus high dose permanent prostate brachytherapy using iodine-125 seeds for patients with high risk prostate cancer: a matched cohort analysis[J]. World J Urol, 2013,31(6):1511-1517.

[5] 丁翔,严春寅.环氧化酶-2在在前列腺肿瘤中的研究进展[J].国外医学：泌尿系统分册,2004,24(2):169-172.

[6] Salvado MD, Alfranca A, Haeggström JZ, et al. Prostanoids in tumor angiogenesis: therapeutic intervention beyond Cox-2[J]. Trends Mol Med, 2012,18(4):233-243.

[7] 左朝晖,黎祖荣,周晓,等.环氧合酶-2抑制剂塞来昔布对人肝癌HepG2裸小鼠移植瘤生长和肿瘤血管生成的抑制作用[J].癌症,2006,25(4):414-420.

[8] 向银洲,余林,魏莲枝,等.塞来昔布对鼻咽癌放射治疗增敏作用的临床研究[J].中国耳鼻咽喉头颈外科,2012,19(1):16.

[9] 梁彩霞,江丹贤.庞雅君.塞来昔布对女性常见恶性肿瘤细胞株的放疗增敏作用[J].实用临床医药杂志,2012,18(3):72-75.

[10] 李丽萍,余志高,李小菊，等.塞来昔布对非小细胞肺癌放疗的增敏作用[J].解放军医药杂志,2017,29(1):40-42.

[11] Ma ZH, Yang Y, Zou L, et al.125I seed irradiation induces up-regulation of the genes associated with apoptosis and cell cycle arrest and inhibits growth of gastric cancer xenografts[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2012,31:61.

[12] Atari-hajipirloo S, Nikanar S, Heydari A, et al. The effect of celecoxib and its combination with imatinib on human HT-29 colorectal cancer cells: Involvement of Cox-2,Caspase-3,VEGF and NF-κB genes expression [J]. Cell Mol Biol( Noisy-le-grand), 2016,62(2):68-74.

[13] Odonkor CA, Achilefu S. Modulation of effect or caspase cleavage determines response of breast and lung tumor cell lines to chemotherapy[J]. Cancer Invest, 2009,27(4):417-429.

[14] 钟漓,张广钰,董陈诚，等. 塞来昔布对胃癌细胞SGC7901凋亡的影响及其作用机制[J].广西医学,2015,37(8):1069-1071.

[15] Liu DB, Long GX, Mei Q, et al. Anticancer effects of celecoxib through inhibiton of STAT3 phosphorylation and AKT phosphorylation in nasopharyngeal carcinoma cell lines[J]. Pharmazie, 2014,69(5):358-361.