ZEB2基因沉默对胃癌细胞奥沙利铂耐药性的影响

陈胜东，王达飞，许益芬，姚亚云，龚伟达

(1 江苏大学医学院，江苏镇江212013；2 宜兴市肿瘤医院)

胃癌5年总生存率低于30%，是导致肿瘤相关死亡的第二大肿瘤，亚洲东部是胃癌发病率最高的地区[1]。目前临床以手术切除为基础，辅以放化疗的综合治疗是胃癌患者的主要治疗方案，奥沙利铂(L-OHP)及其他铂类抗癌药是治疗胃癌的一线化疗用药，然而在化疗过程中对L-OHP产生获得性耐药是导致胃癌患者治疗失败，不良预后甚至死亡的重要原因[2]。近年来，临床采用多药联合的化疗方案，以减少化疗耐药的产生、提高临床疗效，但其疗效并不理想[3]。越来越多的证据表明，肿瘤细胞化疗耐药性的产生多伴随上皮间质转化(EMT)，促进EMT表型的信号通路亦参与了肿瘤化疗耐药性的产生，如TGF-β/Smad4、Wnt/β-catenin信号通路等[4]。据报道，转录因子E盒结合锌指蛋白2(ZEB2)能抑制细胞内E-cadherin表达，促进EMT过程[5]。采用siRNA技术沉默ZEB2基因表达，能逆转EMT过程[6]。尽管ZEB2的功能已被阐明，然而在肿瘤细胞中沉默ZEB2基因表达的研究较少，尤其是胃癌细胞。2015年1月～2016年6月，我们采用siRNA方法沉默ZEB2基因表达，探讨其对胃癌细胞L-OHP耐药性的影响。

1　材料与方法

1.1材料 胃癌SGC-7901细胞株购自中国科学院上海科学院细胞库，RPMI1640培养基、胎牛血清、双抗(青霉素、链霉素)、脂质体Lipofectamine 3000和TRIzol试剂购自美国Invitrogen生命技术有限公司，L-OHP购自齐鲁制药(海南)有限公司，MTT溶液试剂盒购自上海哈灵生物有限公司，siRNA干扰片段购自上海吉玛制药技术有限公司，RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，qRT-PCR引物序列购自上海生工生物工程技术服务有限公司，RIPA裂解液、BCA试剂盒和ECL发光液购自上海碧云天生物技术有限公司，羊抗人ZEB2多克隆抗体(ab138222)购自美国Abcam公司，鼠抗人GAPDH单克隆抗体(sc-420486)购自美国Santa Cruz公司，HRP标记的鼠抗羊和兔抗鼠二抗分别购自南京金斯瑞生物科技有限公司和上海碧云天生物技术有限公司，Annexin V-FITC/PI试剂盒购自美国BD公司。培养箱(MCO-18AC，日本SANYO公司)，全波长酶标仪(Bio-Rad 公司，美国)，紫外分光光度计(ND-2000，美国Thermo Fisher Scientific科技公司)，荧光定量PCR仪(ABI PRISM®7300，美国ABI公司)，凝胶成像仪(Tanon 4200 SF，上海天能科技有限公司)，流式细胞仪(FACSCanto Ⅱ，美国BD公司)。

1.2耐药乳腺癌细胞株的构建采用间歇刺激法诱导建立胃癌SGC-7901细胞的耐药细胞株，细胞均生长于RPMI1640培养基(含10%胎牛血清，10×104U/L青霉素，100 mg/L链霉素)中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。高浓度L-OHP (注) 20 μg/mL作用于对数生长期的SGC-7901细胞，4 h后撤药，恢复正常RPMI1640培养液进行培养，每周刺激1次，6个月内共刺激12次，建立的耐药细胞株命名为SGC-7901/L-OHP。

1.3L-OHP对SGC-7901和SGC-7901/L-OHP细胞的半数抑制浓度(IC50)值测算采用MTT法。取处于对数生长期的SGC-7901和SGC-7901/L-OHP细胞，分别接种于96孔板中，每孔接种8×103个细胞，24 h后，弃去旧培养液，每孔分别加入100 μL含有不同浓度L-OHP(0、2.5、5.0、10.0、100、200、400 μg/mL)的RPMI1640培养液，设置3个复孔，继续培养48 h。弃上清，每孔加入100 μL的MTT溶液(0.5 mg/mL)，37 ℃恒温孵育4 h，弃上清MTT溶液，每孔加入100 μL DMSO溶剂，充分溶解后，全波长酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值，计算细胞存活率。SPASS软件计算IC50值，耐药指数(RI)=耐药细胞的IC50/亲本细胞的IC50。

1.4沉默ZEB2基因表达后SGC-7901/L-OHP细胞对L-OHP药物敏感性检测采用MTT法。脂质体转染siRNA-ZEB2或siRNA-NC至SGC-7901/L-OHP细胞中12 h后，不同浓度L-OHP(0、2.5、5.0、10.0、100、200、400 μg/mL)分别处理空白对照组、NC组和si-ZEB2组的SGC-7901/L-OHP细胞48 h，MTT法检测L-OHP对各组SGC-7901/L-OHP细胞的IC50值。

1.5siRNA-ZEB2对ZEB2基因的沉默效率测算采用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting法。取4×105个处于对数生长期的SGC-7901/L-OHP细胞，接种于3.5 cm培养皿中，24 h后分为空白对照组、si-ZEB2组和NC组，si-ZEB2组和NC组采用脂质体Lipofectamine3000分别将siRNA-ZEB2(正向引物：5′-GGCAAGGCCUUCAAAUAUATT-3′，反向引物：5′-UAUAUUUGAAGGCCUUGCCTT-3′)、siRNA无关序列(阴性对照组即NC组)转染至SGC-7901/L-OHP细胞中，空白对照组不转染siRNA的SGC-7901/L-OHP细胞，操作步骤参照试剂说明书。

1.6ZEB2 mRNA表达检测采用qRT-PCR法。TRIzol法抽提细胞总RNA，参照RNA提取试剂盒说明书操作。紫外分光光度计检测总RNA浓度及纯度，逆转录试剂盒进行逆转录。ZEB2：正向引物：5′-AGGAGCAGGTAATCG-3′，反向引物：5′-TGGGCACTCGTAAGG-3′。荧光定量PCR仪检测ZEB2 mRNA表达。qRT-PCR扩增体系为10 μL，反应条件：50 ℃，2 min，95 ℃，10 min，95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，进行35个循环。采用2-ΔΔCt方法计算ZEB2的mRNA相对表达量。

1.7ZEB2 蛋白表达检测采用Western blotting法。收集细胞，RIPA裂解液抽提细胞全蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。8% SDS-PAGE胶电泳分离蛋白后，湿转法将蛋白转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温振荡封闭1 h，TBS-T洗膜，分别加入羊抗人ZEB2多克隆抗体和鼠抗人GAPDH单克隆抗体，4 ℃孵育过夜。TBS-T洗膜后，分别加入HRP标记的鼠抗羊和兔抗鼠二抗,室温孵育1 h，加ECL发光液进行化学发光显影，凝胶成像仪观察蛋白条带。

1.8细胞凋亡检测采用流式细胞术(FCM)。脂质体转染siRNA-ZEB2或siRNA-NC至SGC-7901/L-OHP细胞12 h后，20 μg/mL L-OHP分别处理空白对照组、NC组和si-ZEB2组的SGC-7901/L-OHP细胞48 h，采用FCM，Annexin V-FITC/PI双染法检测各组SGC-7901/L-OHP细胞凋亡百分比，收集各组细胞，PBS洗涤2次，加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，随后加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL PI，混匀，室温避光孵育10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡百分比。

2　 结果

2.1SGC-7901/L-OHP细胞株的建立 MTT实验结果显示，SGC-7901、SGC-7901/L-OHP的IC50值分别为(13.02±3.14)、(100.75±14.16)μg/mL，SGC-7901/L-OHP细胞的RI为7.69，SGC-7901/L-OHP为L-OHP的稳定耐药细胞株。

2.2SGC-7901和SGC-7901/L-OHP细胞中ZEB2表达比较 qRT-PCR结果显示，SGC-7901和SGC-7901/L-OHP细胞中ZEB2 mRNA相对表达量分别为1.12±0.21、5.62±1.28,ZEB2蛋白相对表达量分别为1.06±0.13、3.38±1.33，耐药细胞SGC-7901/L-OHP中ZEB2的mRNA和蛋白表达均高于亲本SGC-7901细胞(P均<0.05)。

2.3沉默ZEB2基因表达后SGC-7901/L-OHP细胞对L-OHP药物敏感性的影响MTT实验结果显示，si-ZEB2组SGC-7901/L-OHP细胞的IC50值为(27.06±7.43)μg/mL，低于空白对照组的(100.7±14.43)μg/mL和NC组的(91.95±16.43)μg/mL(P均<0.05)，而空白对照组和NC组间差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

实施sbar交班模式后,晨交班时间为(18.25±2.68)min,相比于实施前晨交班时间(26.47±2.97)min,平均缩短8min,实施前后晨交班时间对比差异存在统计学意义,t=10.8729,P<0.05。

图1　　　　沉默ZEB2基因表达后SGC-7901/L-OHP细胞对L-OHP药物敏感性

2.4siRNA-ZEB2对ZEB2基因的沉默效率脂质体转染siRNA-ZEB2或siRNA-NC至SGC-7901/L-OHP细胞中12 h后，qRT-PCR结果显示，ZEB2的mRNA表达降低至空白对照组和NC组的0.41倍(P<0.05)，而空白对照组和NC组间无统计学差异(P>0.05)；Western blotting实验结果显示，ZEB2蛋白表达降低至空白对照组和NC组的0.37倍(P均<0.05)，而空白对照组和NC组间无统计学差异(P>0.05)，表明siRNA-ZEB2干预后SGC-7901/L-OHP细胞中ZEB2基因表达沉默。

2.5各组细胞凋亡率比较FCM实验结果显示，si-ZEB2组、空白对照组、NC组SGC-7901/L-OHP细胞凋亡率分别为55.32%±9.63%、20.63%±3.28%、22.83%±4.81%，si-ZEB2组与空白对照组、NC组比较，P均<0.05；而空白对照组和NC组比较，P>0.05。

3　 讨论

早期胃癌患者的治疗以手术切除为主、化疗为辅，然而多数患者就诊时已处于晚期，只能化疗为主，以提高患者生活质量、延长生存时间。铂类抗癌药是胃癌化疗的一线用药，L-OHP是继顺铂和卡铂之后的第三代铂类抗癌药，具有抗癌谱广、溶解性及稳定性好等特点，因其疗效确切，已逐渐成为治疗晚期胃癌的主要药物，但在化疗过程中获得性耐药的产生，是导致化疗失败的原因之一。

本研究以SGC-7901为亲本细胞，采用体外间歇刺激法，成功建立人胃癌L-OHP耐药细胞株SGC-7901/L-OHP，并采用MTT法检测亲本细胞SGC-7901及耐药细胞SGC-7901/L-OHP对L-OHP的敏感性和IC50值，结果显示，SGC-7901/L-OHP细胞对L-OHP的RI为7.69，建立的SGC-7901/L-OHP细胞株对L-OHP属于中度耐药[7]，可用于进一步实验研究。

EMT是诱发肿瘤细胞发生浸润转移的早期关键事件，近年来，大量研究发现，肿瘤细胞EMT的发生与耐药性的产生密切相关。Shen等[8]报道，在子宫颈癌细胞中过量表达microRNA-375促进EMT发生的同时，不仅降低了细胞的增殖能力，且降低了癌细胞对紫杉醇的敏感性；在非小细胞肺癌A549细胞中，沉默MCL-1基因表达，能逆转EMT介导的化疗耐药[9]。最新证据表明，在卵巢癌[10]的耐药细胞中，存在ZEB2过量表达。本研究结果显示，SGC-7901/L-OHP细胞中ZEB2的mRNA和蛋白表达高于SGC-7901细胞，差异有统计学意义，提示ZEB2参与了SGC-7901获得性耐药的产生过程。

Fang等[11]在非小细胞肺癌的多药耐药细胞H69AR中敲除ZEB2表达后，部分逆转了细胞的多药耐药表型。ZEB2作为抑制E-cadherin表达的转录因子，是EMT过程的主要激活因素，在肿瘤细胞化疗耐药中占重要地位。然而，胃癌中并没有以沉默ZEB2基因表达为基础的治疗方案。SiRNA是一类在肿瘤治疗中有巨大应用前景的治疗方案，可通过siRNA沉默肿瘤相关蛋白的表达，进而抑制肿瘤的恶性进展[12]。

本研究中，MTT试验结果显示，L-OHP对si-ZEB2组SGC-7901/L-OHP细胞的IC50值低于空白对照组和NC组，差异有统计学意义；相同浓度L-OHP处理空白对照组、NC组和si-ZEB2组SGC-7901/L-OHP细胞后。FCM试验结果显示，si-ZEB2组SGC-7901/L-OHP细胞凋亡百分比高于空白对照组和NC组，差异有统计学意义，以上试验结果初步证实，沉默ZEB2基因表达，能增强SGC-7901/L-OHP细胞对L-OHP的化疗敏感性，增加细胞凋亡比例，与Jin等[13]研究结果一致。

综上所述，本研究成功建立对L-OHP耐药的胃癌细胞株SGC-7901/L-OHP，且发现ZEB2在SGC-7901/L-OHP耐药细胞中的表达增加，采用siRNA干扰技术沉默SGC-7901/L-OHP耐药细胞中ZEB2基因表达后，减弱了细胞对L-OHP的耐药性。

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