Gli1对人肝癌细胞中Twist1蛋白表达及细胞迁移的影响

甘鲁慧，吕沐瀚，邓明明

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

肝细胞癌近年发病率高，是癌症相关死亡的第三大原因[1]。其中，肝细胞癌的高异质性是导致癌细胞复发转移扩散的关键因素[2]。因此，阐释其侵袭、转移机制是防治肝细胞癌的关键。文献证实，上皮细胞间质转化(EMT)是上皮细胞丢失细胞间连接而获得间质细胞特性的生物转化过程，是肿瘤侵袭转移的重要特征，而通过调控EMT可促进肝癌细胞侵袭转移[3]。研究发现，Hedgehog信号通路参与生物体内细胞的增殖、发育[4]，Hedgehog信号激活通路中关键蛋白Gli1转位进入细胞核内,干预下游靶基因参与调控EMT。在下游的核转录因子中，Twist1在转录水平上抑制E-Cadherin表达，诱导EMT形成[5]。然而，Gli1是否会通过Twist1而实现调控人肝癌细胞的增殖迁移尚不清楚。2017年9月，我们通过筛选Gli1高表达细胞系构建稳定的GLi1siRNA，探讨Hedgehog信号通路关键蛋白Gli1对人肝癌细胞中Twist1蛋白表达及增殖迁移的影响。

1　材料与方法

1.1材料 Huh7、hepG2、PLC、SMMC-7721、Bel-7404五种人肝癌细胞购自中科院上海细胞库。根据网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov获得Gli1基因的cDNA序列，采用在线设计工具设计siRNA，经BLAST比对分析与人类其他基因编码序列无同源性，在候选靶序列中选取3条序列：GLi1siRNA1:5′-GCACCAAACGCTATACAGA-3′;GLi1siRNA2:5′- CTCCACAGGCATACAGGAT-3′;GLi1siRNA3:5′-TCATACTCACGCCTCGAAA-3′，设计阴性对照，由广州锐博生物公司合成。兔抗人Gli1、Twist1、E-cadherin、N-Cadherin和Vimentin单克隆抗体、GAPDH单克隆抗体及二抗均购自美国Santa Cruz公司，逆转录试剂盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)、扩增试剂盒(SYBR ® Premix Ex TaqTM Ⅱ)(TaKaRa 公司)。

1.2细胞系Gli1蛋白表达检测采用Western blotting技术，主要操作流程参照文献[6]。移除细胞培养液，用预冷PBS液洗3次，加入蛋白裂解液后冰浴超声匀浆30 min，4 ℃，12 000 g离心15 min，去除上清液，BCA法测定各组蛋白浓度，加入上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min。取40 μg总蛋白经12%SDS-PAGE凝胶分离，冰水环境、40 V恒压转膜。5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST漂洗后加入Gli1一抗(1∶1 000)，4 ℃摇床过夜，TBST洗膜3次后加入二抗37 ℃ 2 h。TBST清洗后于Image Lab系统下显影成像，以目的蛋白/GAPDH条带灰度值作为其相对表达量。

1.3质粒转染参考文献[7]，将1.2步骤中筛选的Gli1高表达人肝癌细胞系于生长对数期时，将3个重组质粒(广州锐博生物公司提供)转染，分别为pGCsi-U6-GLi1siRNA-1(siRNA-1组)、pGCsi-U6-GLi1siRNA-2(siRNA-2组)、pGCsi-U6-GLi1siRNA-3(siRNA-3组)，而空白对照组(N组)不转染任何序列，阴性对照组转染阴性对照序列(NC组)。各组质粒DNA均采用4 μg，6 h后弃转染复合物，加入 DMEM/F12条件培养液中继续培养48 h。

1.4Gli1 mRNA相对表达量检测采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，操作步骤：于培养48 h后，收集转染细胞，用TRIzol法提取总RNA，用ddH2O稀释1 μL样品200倍后测定RNA浓度与纯度。引物由Primer软件设计、Takara公司合成，参照反转录试剂盒说明 ，42 ℃反转录50 min，95 ℃ 5 min灭活反转录酶。Gli正向引物:5′-CCAGCCAGAGAGACCAACAG-3′,反向引物:5′-CCCGCTTCTTGGTCAACTT-3′,GAPDH正向引物:5′-CTGACTTCAACAGCGACACC-3′,反向引物:5′-TGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′，其反应体系为SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2X)12.5 μL、正反向引物各1 μL、cDNA 2 μL和dH2O 8.5 μL，95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。定量分析mRNA采用2-ΔΔCt法进行计算。Western blotting技术主要操作流程同1.2步骤。

1.5细胞迁移距离测算进行细胞划痕实验。实验步骤参考文献[8]，用10 μL的枪头在下室细胞中垂直与6孔板划两条垂直交叉的划痕，PBS清洗每孔3次，清洗划掉的细胞，然后加入无血清培养液，用倒置荧光显微镜(OLYMPUS)拍照，放入培养箱继续培养24 h后再次拍照。用倒置荧光显微镜拍照内置软件(cellSens Standard)计算出细胞迁移距离。

1.6细胞中Twist1蛋白、E-Cadherin蛋白表达检测采用Western blotting技术。主要操作流程同1.2步骤。其中Twsit1一抗稀释度为1∶1 000，E-Cadherin一抗稀释度为1∶1 000。

2　结果

2.1五种高转移性人肝癌细胞中Gli1蛋白表达比较 Gli1蛋白在五种高转移性人肝癌细胞Huh7、SMMC-7721、PLC、HepG2、Bel-7404中相对表达量分别为0.12±0.04、0.39±0.08、0.41±0.05、0.38±0.06、0.76±0.13，经LSD-t检验，Gli1蛋白在Bel-7404细胞中相对表达量高于其他细胞中(P均<0.05)，Gli1蛋白在Huh7细胞中相对表达量低于SMMC-7721、PLC、HepG2细胞中(P均<0.05)，Gli1蛋白在SMMC-7721、PLC、HepG2细胞中的表达差异无统计学意义。

2.2各组转染细胞中Gli1 mRNA和蛋白表达比较选择Gli1蛋白表达量最高的Bel-7404细胞进行转染，N组、NC组、GLi1siRNA1组、GLi1siRNA2组、GLi1siRNA3组细胞中Gli1蛋白相对表达量分别为0.64±0.08、0.60±0.03、0.18±0.05、0.07±0.02、0.19±0.02。三种GLi1siRNA对Gli1蛋白抑制率分别为71.86%、89.06%、70.77%(P=0.000)。经 LSD-t检验，Gli1蛋白在GLi1siRNA2组转染细胞中相对表达量低于其他组(P均<0.05)。qRT-PCR检测结果显示，N组、NC组、GLi1siRNA1组、GLi1siRNA2组、GLi1siRNA3组细胞中Gli1 mRNA相对表达量分别为0.85±0.12、0.80±0.06、0.37±0.07、0.15±004、0.35±0.05。三种GLi1siRNA均对Gli1 mRNA产生了较好的抑制效果，抑制率分别为75.74%、90.06%、71.52%(P=0.000)。Gli1 mRNA在GLi1siRNA2组转染细胞中相对表达量低于其他组(P均<0.05)。

2.3细胞迁移距离比较将筛选的Gli1抑制效果最佳的GLi1siRNA2组细胞、N组细胞进行划痕实验比较，在划痕24 h后，与N组比较，GLi1siRNA2组细胞的划痕间距值增加，细胞的迁移距离降低(P均<0.05)，提示GLi1siRNA2组细胞的迁移、修复能力降低。N组、GLi1siRNA2组细胞的划痕间距值分别为(103.87±16.39)、(458.78±40.55)μm。

2.4EMT相关蛋白表达检测结果N组、GLi1siRNA2组Twsit1蛋白相对表达量分别为1.12±0.15、0.53±0.12，E-Cadherin蛋白相对表达量分别为0.22±0.05、0.72±0.14，N-Cadherin蛋白相对表达量分别为0.81±0.11、0.26±0.04，Vimentin蛋白相对表达量分别为0.66±0.14、0.17±0.03，GLi1蛋白相对表达量分别为0.65±0.08、0.17±0.03。经两独立样本t检验，与N组比较，GLi1siRNA2组的Twsit1、GLi1、N-Cadherin和Vimentin蛋白相对表达量降低，E-Cadherin蛋白相对表达量增加，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

3　讨论

Hedgehog信号通路在肿瘤的细胞增殖、细胞周期调控、侵袭转移等病理生理过程发挥重要作用，甚至与肿瘤耐药密切相关[9]。在人肝细胞癌中，Hedgehog信号通路中的Gli1在临床肝细胞癌组织标本中有较高的阳性表达率且与肿瘤分化程度和淋巴结转移相关，可能作为判断肝细胞癌恶性程度及预后的指标[10]。基础研究证实[11]，阻挡Gli1可抑制人肝癌细胞的侵袭与转移。为研究Hedgehog信号通路关键蛋白Gli1对人肝癌细胞中Twist1蛋白表达及增殖迁移的影响，我们通过在 Huh7、HepG2、PLC、SMMC-7721、Bel-7404五种细胞中，通过Western blotting筛选出Gli1高表达的Bel-7404进行了siRNA干预，在设计的三组siRNA中，挑选抑制Gli1效率最高的组进行分析Bel-7404细胞Twist蛋白表达情况和迁移修复能力。本研究结果显示，通过siRNA沉默Gli1后，成功抑制了人肝癌Bel-7404细胞的侵袭与转移，此与Chen等[12]研究结果一致。研究发现，Gli1产生这种效应的机制可能与在转录水平上调转化因子β1受体、C端结合蛋白2[13]等促进肝癌细胞EMT。而Twist1可显著性促进癌细胞EMT[14]，抑制Twist1可限制肿瘤转移甚至逆转其耐药性[15]，这可能与Twist1作用于PcG家族中的Bmi1基因促进了肿瘤细胞向干细胞分化[16]，而Twist1又可接受肿瘤微环境中促炎性因子TNF-α通过经典的NF-κB通路诱导[17]，形成一个正反馈放大通路。但Twist1表达是否接受Gli1调控仍未知。在本研究中通过抑制Gli1的同时，Twist1表达量显著性下调，而人肝癌Bel-7404细胞中EMT的特征性蛋白E-Cadherin却表达增加，N-Cadherin和Vimentin下调。提示Gli1可能作用于Twist1而实现EMT的调节。

Gli1是Hedgehog信号通路中的重要转录因子，Hedgehog信号通路与肿瘤的细胞增殖、侵袭转移密切相关[9]。而Twist1可显著性促进肝癌细胞EMT[14]，上皮间质化是肝癌细胞侵袭转移的重要原因，在出现 EMT 时,可视为肝癌细胞侵袭转移的开始。在EMT过程中的特征性变化包括：上皮细胞的标志E-Cadherin下调、β-catenin 的核转位聚集，间质细胞的标志N-Cadherin、Vimentin上调等[16,17]。

综上所述，siRNA沉默Hedgehog信号通路关键蛋白Gli1后，Twist1下调，EMT抑制，提示在人肝癌细胞Bel-7404中，Hedgehog/Gli1通路可能通过作用于Twist1而实现EMT的调节，此将为肝细胞癌的发生机制研究与防治工作提供参考。但本研究尚未观察Gli1与Twist1的相互作用，亦未验证肝癌临床标本中二者在病理检测中的相关性，有待于后续探究。

参考文献：

[1] Forner A, Llovet JM, Bruix J. Hepatocellular carcinoma[J]. Lancet, 2012,379(9822):1245-1255.

[2] Han K, Kim JH. Transarterial chemoembolization in hepatocellular carcinoma treatment: Barcelona clinic liver cancer staging system[J]. World J Gastroenterol, 2015,21(36):10327-10335.

[3] 孙加林,王彤.肝细胞生长因子受体c-Met调控肝癌细胞上皮间质转化的作用机制[J].中华肝胆外科杂志,2017,23(2):142-144.

[4] Gorojankina T. Hedgehog signaling pathway: a novel model and molecular mechanisms of signal transduction[J]. Cell Mol Life Sci, 2016,73(7):1317-1332.

[5] D′Angelo RC, Liu XW, Najy AJ, et al. TIMP-1 via Twist11 induces EMT phenotypes in human breast epithelial cells[J]. Molecular Cancer Research Mcr, 2014,12(9):1324-1333.

[6] 胡洁芬,廖静秋,张伟杰,等.Hedgehog/Gli1通路在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用[J].中国病理生理杂志,2015,31(2):234-238.

[7] 郭杰芳,高军,龚燕芳,等.靶向人转录因子GLI1基因的RNAi真核表达载体的构建与鉴定[J].中华胰腺病杂志,2013,13(2):118-121.

[8] 王雷,王林,米源,等.Gli抑制剂GANT61抑制食管腺癌细胞发生上皮-间质转化[J].肿瘤,2016,36(1):35-42.

[9] 黄少良,赵丽,郭青龙,等.Hedgehog信号通路参与肿瘤耐药机制研究的最新进展[J].中国药科大学学报,2016,47(3):259-266.

[10] 虞玲华,殷新光,余亚威,等.肝细胞肝癌中Hedgehog信号通路效应蛋白的功能分析[J].中华肝胆外科杂志,2013,19(3):198-200.

[11] 常远鸿,江梅,刘凯歌.Hedgehog通路阻断剂抑制肝癌细胞株Hep3B侵袭作用的机制[J].中华消化杂志,2012,32(12):864-865.

[12] Chen JS, Li HS, Huang JQ, et al. Down-regulation of Gli-1 inhibits hepatocellular carcinoma cell migration and invasion[J]. Mol Cell Biochem, 2014,393(1-2):283-291.

[13] Xin Z, Tao S, Dou C, et al. CtBP2 is an independent prognostic marker that promotes GLI1 induced epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget, 2015,6(6):3752-3769.

[14] Qiang L, He YY. Autophagy deficiency stabilizes TWIST1 to promote epithelial-mesenchymal transition[J]. Autophagy, 2014,10(10):1864.

[15] 马艳萍,王楠,郭丹,等.Twist-1通过MPL促进髓系白血病细胞增殖和耐药[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2017,24(6):588-594.

[16] Wu KJ, Yang MH. Epithelial-mesenchymal transition and cancer stemness: the Twist1-Bmi1 connection[J]. Bioscience Reports, 2011,31(6):449.

[17] Li CW, Xia W, Huo L, et al. Epithelial-mesenchymal transition induced by TNF-α requires NF-κB-mediated transcriptional upregulation of Twist1[J]. Cancer Research, 2012,72(5):1290.