遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征1例家系易感基因的初步筛选

孙　丽,张有为,曹苏生,张培影,孙三元

(徐州市中心医院肿瘤内科,徐州　221009;*通讯作者,E-mail:ss05181@189.cn)

乳腺癌(breast cancer,BC)和卵巢癌(ovarian cancer,OC)是表现为家族聚集倾向的常见女性恶性肿瘤,罹患相应肿瘤家族史是二者最重要的危险因素,表明遗传因素在BC和OC发病中的重要意义[1,2]。遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征(hereditary breast and ovarian cancer syndrome,HBOC),指1个家族中有2个一级亲属或1个一级亲属和1个二级亲属患乳腺癌或卵巢癌,并具有遗传倾向[3]。HBOC对于研究BC和OC的分子遗传机制具有重要价值。我科于2013年7月收治BC和OC双源肿瘤患者1例,经详细询问家族史,绘制出家系图谱(见图1),该家系4代中共有7例癌症患者,其中4例为BC和OC双源肿瘤,1例为双侧卵巢癌,且发病年龄均小于60岁,符合HBOC诊断。为鉴定该家族HBOC易感基因,我们对核心成员的静脉血样进行全外显子组测序(whole exome sequencing,WES),初步结果报道如下。

1　资料与方法

1.1　临床资料

项目组于徐州、南京、天津三地收集齐全46名家族成员的静脉血样,同时调查其临床信息,采血和调查之前均获得家族成员的知情同意。如图1所示,101、205、207、217为HBOC患者,219仅为双侧卵巢癌患者,305和313为纵隔肿瘤患者。首先选择101、203和207三个样本进行WES。本研究经我院伦理委员会批准进行。

205为先证者,219仅为双侧卵巢发病,101和102为姐弟关系,101有两次婚姻史图1　HBOC家系图Figure 1　Family tree of hereditary breast and ovarian cancer syndrome

1.2　主要试剂及仪器

血液DNA提取(QIAamp DNA Blood Maxi Kit,德国Qiagen公司),捕获磁珠(AmpureBeads,美国Beckman公司),DNA定量(Quant-iTTMPicoGreen®dsDNA Assay Kit,美国life公司),DNA建库(TruSeq®DNA LT Sample Prep Kit v2,美国illumina公司),Exon捕获(Nimblegen Exome Kit V4,Roche公司),测序试剂1(TruSeq PE Cluster Kit-cBot-HS3000,美国Illumina公司),Hisq3000高通量测序仪(美国Illumina公司),循环测序试剂盒(BigDye,美国ABI公司),ABI-3730XL测序仪(美国ABI公司)。

1.3　方法

1.3.1DNA提取及纯化根据Qiagen公司提供的标准操作流程进行血液样本DNA的抽提及纯化,DNA经Qubit荧光定量仪(美国Thermo公司)和1%琼脂糖凝胶电泳质检合格后备用。

1.3.2外显子组测序gDNA用Biorupter超声破碎仪打断,DNA片段的大小为200-300 bp,修复末端A加至3′的末端、接头相连接,以AmpureBeads磁珠纯化连上接头的模板片段,经接头介导的PCR(ligation-mediated PCR,LM-PCR)扩增、纯化后与NimbleGen 2.1M(外显子靶向序列捕获芯片)进行杂交,洗脱未杂交的片段。捕获与未捕获的LM-PCR产物均进行定量PCR,用来评估富集的程度。每个完成捕获的外显子组文库均被加载到Illumina Hiseq3000测序平台,进行双末端测序,测序长度达到75 bp,测序深度达到50X。WESBWA序列比对,采用GATK和VarScan软件对突变及变异进行识别,包括对单核苷酸变异(single nucleotide variants,SNVs)、小片段的插入和缺失(insertion and deletion,InDel)等进行检测、注释,过滤掉dbSNP数据库和千人基因组计划数据库中已知的SNP。

1.3.3基因重测序提取201,205,209,217,219,305和313样本的DNA,通过primer 5.0设计目的基因引物(见表1),由华大基因合成引物,采用KAPA2G Fast Multiplex Mix进行PCR扩增,PCR产物电泳,按AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明进行PCR产物纯化。将待测模板加入ABI BigDye Mix及引物进行测序反应、醋酸钠/乙醇法纯化、按照ABI3730XL测序仪操作说明上机。

1.3.4基因表达验证利用Bioconductor/TCGAbiolinks函数包从TCGA(the Cancer Genome Atlas Project)数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)下载并预处理乳腺癌(BRCA)数据集的mRNA表达RNASEqV2数据。从GEO(Gene Expression Omnibus)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下载卵巢癌样本GSE12470的series matrix数据，使用Robust Multi-array Average(RMA)算法处理原始数据(.CEL文件)。从表达谱数据中提取FAM83E基因表达值，再比较其在癌组织与临近正常组织表达中的差异。

表1目的基因的引物序列

Table1Primersequencesoftargetgenes

基因 上游序列 下游序列 PPIECACGTAGACTCGCACCCAAGGCTCAGAGCAGCTTTTGGDOCK3TCCTCCACTACCCATCGCAAACCAGTGCTGACAATGCTGADAMTS9TTCCCATAGAGGGCATGGAGTCCCATCTCTCTTCATTTGCAGCTOMM70AGATTCGGGACCAACCAGGGTAGTGGCCATGGAGTCCTAGTPIGZCTGTGGTCCCCCTCTACCTCGGAGGGGAATCAGGAACCGATTLL5CAGTGACTGACACAAATGCCCAGAGTGACATGTGGGTGCTATCYB5D2TTGAATACCCAGCGTGTGCTGCGGGAATGTCTGCTTCTCTMAP3K14GTCGCAATCTCCCAACAACCCTTGTGGTAGACCCCAGCACITGA3CCTTCCTGGTGGCTCAAACTGCCCCCGTAGACAACCTTAGLGALS3BPAGATGCCCCTGGACCTGTATCTGGATGGTGGGGAGGTAGATPRX1TGCCAGACACCCAGTTATTCCCAAAATGCAAATAGGAAAGGT-GTCTFAM83EGACTCTGACCCCCTACTCCCAGGCGTGCAGGAAATGAACALOC100507003TCTAGGACCCCTCGCTGAAATGGGGTCTCAGTGGAGTTGAZNF616CCAGTGCCCCATGAAAACAACCAGTGTGACTCCTTTGGTGTPRR14LAGGTCAGTCAGCCAAGGAGACAGCATCCAGTTCTCTCCGAATP5L2GGCCATTCGGGATGATGGACTTATAAAACCACGTCGACACCTCA

1.4　统计学分析

采用SPSS16.0统计软件,两样本均值比较采用Student’sttest,P<0.05为差异有统计学意义。生物信息学数据分析由上海晶能生物公司协助完成。

2　结果

2.1　外显子测序

本研究采用Nimblegen/Roche公司的外显子捕获平台,对101,203,207样本进行外显子组捕获,IllumineHiseq 3000高通量测序仪进行双末端测序。对三个样品的突变进行注释,数据分析。取101和207共有的、而203没有的突变位点,对这部分位点进行dbSNP过滤,得到可能与HBOC发病相关的16个突变基因(见图2,表2)。

2.2　基因重测序

将上述16个突变基因在201,205,209,217,219,305和313七个样本中进行重测序验证,发病者中均有FAM83E基因突变(NM-017708:p.Ser387Gly),男性成员201也携带该突变(见表3)。

2.3　基因表达分析

分析TCGA乳腺癌数据和GSE12470卵巢癌数据,可见FAM83E基因在BC和OC组织中的表达,较正常组织明显升高(见图3)。

对三个样品的突变进行注释,其中101和207共有的,而203没有的突变共938个图2　全外显子测序结果Figure 2　Results of whole exome sequencing

3　讨论

大多数HBOC综合征由BRCA1和BRCA 2种系突变(germline mutation)引起,BRCA 1/2基因作用于DNA的损伤修复、细胞周期的调控和凋亡,能够维持基因组的完整性,促进损伤细胞的凋亡,抑制细胞癌变[4,5]。仍有部分HBOC病因尚未得到很好的解释,目前对于其他易感基因的研究越来越得到重视,包括Fanconi贫血相关(FANCD2、FANCA、FANCC),错配修复(MMR)相关(MLH1、MSH2、PMS1、PMS2、MSH6),DNA检验点相关(ATM、ATR、CHK1/2)以及一些抑癌基因(TP53、SKT11、PTEN)在多种肿瘤综合征中都被证实与增加的BC和OC风险有关[6,7]。WES又称为定向外显子组捕获(tar-geted exome capture),可选择性地对人类基因组的编码区进行测序,从而发现罕见及常见疾病相关的异常基因[8]。最近,Määttä等[9]通过WES对13个HBOC家系的研究发现,DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)途径中的18个突变基因与肿瘤发病有关,其中,ATM、MYC、PLAU、RAD1和RRM2B基因变异在HBOC患者中的比例显著高于对照者(优势比1.16-2.16)。我们运用该方法筛选出的FAM83E基因,此前尚未有报道。根据连锁分析、候选基因的突变和关联分析的方法,鉴别不同风险的遗传易感基因,将其分为高外显率、中外显率和低外显率易感基因3类。FAM83E突变(p.Ser387Gly)软件预测为中外显率(moderate),不能排除该家系中以复合杂合形式存在的隐性遗传模式的突变基因。

表2938个突变dbSNP过滤后初步筛选的候选易感基因

Table2Candidatesusceptiblegenesin938mutateddbSNPafterpreliminaryscreening

染色体定位 基因 外显子生物型转录本 密码子改变功能影响 chr1-40228236PPIEMISSENSENM-001195007:p.Asn295LysaaC/aaAMODERATEchr3-51378785DOCK3MISSENSENM-004947:p.Arg1295GlncGg/cAgMODERATEchr3-64666963ADAMTS9MISSENSENM-182920:p.Glu198GlygAg/gGgMODERATEchr3-100091482TOMM70AMISSENSENM-014820:p.Arg474GlyAgg/GggMODERATEchr3-196674932PIGZMISSENSENM-025163:p.Tyr279SertAt/tCtMODERATEchr14-76232602TTLL5MISSENSENM-015072:p.Lys636GluAaa/GaaMODERATEchr17-4057991CYB5D2MISSENSENM-144611:p.Gly139ArgGga/AgaMODERATEchr17-43347856MAP3K14MISSENSENM-003954:p.Arg632ThraGg/aCgMODERATEchr17-48166507ITGA3MISSENSENM-005501:p.Ile1027ValAtc/GtcMODERATEchr17-76968197LGALS3BPMISSENSENM-005567:p.Arg407TrpCgg/TggMODERATEchr19-48305157TPRX1MISSENSENM-198479:p.Met371ValAtg/GtgMODERATEchr19-49106768FAM83EMISSENSENM-017708:p.Ser387GlyAgt/GgtMODERATEchr19-49929883LOC100507003MISSENSENM-001195256:p.Tyr66HisTac/CacMODERATEchr19-52619875ZNF616MISSENSENM-178523:p.Arg181LysaGg/aAgMODERATEchr22-32110652PRR14LMISSENSENM-173566:p.Thr1058MetaCg/aTgMODERATEchr22-43036201ATP5L2MISSENSENM-001165877:p.Leu27SertTg/tCgMODERATE

表316个候选易感基因在其他家系成员中的重测序验证

Table3Validationof16candidatesusceptiblegenesinotherfamilymembersbyresequencing

基因201205209217219305313PPIE-------DOCK3-GG-GA-GG-GA--GG-GAADAMTS9-TT-TC-TT-TC--TT-TCTOMM70ATT-TCTT-TC--TT-TC--PIGZ------AA-ACTTLL5-TT-TCTT-TC----CYB5D2--GG-GA-GG-GA-GG-GAMAP3K14CC-CGCC-CGCC-CGCC-CGCC-CG--ITGA3AA-AGAA-AGAA-AGAA-AGAA-AG--LGALS3BP---CC-CTCC-CT--TPRX1AA-AG-AA-AG-AA-AG--FAM83EAA-AGAA-AG-AA-AGAA-AG--LOC100507003TT-CTTT-CTTT-CT-TT-CT--ZNF616GG-GAGG-GAGG-GA-GG-GA--PRR14L---CC-CTCC-CT-CC-CTATP5L2--TT-TCTT-TCTT-TC-TT-TC

“-”表示无突变

A. TCGA乳腺癌数据显示乳腺癌组织FAM83E表达较正常组织明显升高B. GSE12470卵巢癌数据显示卵巢癌组织FAM83E表达较正常组织明显升高图3　生物信息学分析FAM83E基因在乳腺癌和卵巢癌中的表达Figure 3　Expression of FAM83E gene in breast cancer and ovarian cancer by bioinformatics analysis

FAM83E(family with sequence similarity 83,member E)属于一个高度保守的FAM83基因家族,该家族成员具有癌基因特点,在大多数人类肿瘤中表达上调[10]。目前研究较多的是FAM83B。Cipriano等[11]基于慢病毒的可验证插入突变(validation based insertional mutagenesis,VBIM)系统发现驱动人类乳腺上皮细胞(HME1)恶性转化的FAM83B基因,进一步real-time PCR分析表明,FAM83B在多种肿瘤组织中的表达明显比正常组织升高,包括乳腺、肺、卵巢、宫颈、睾丸、甲状腺、膀胱癌和淋巴瘤,并且FAM83B上调与某些特殊肿瘤亚型、肿瘤分级和不良预后相关[12]。在乳腺癌、肺癌、卵巢癌和宫颈癌细胞(MCF7、H1299、SKOV3和Hela)中干涉FAM83B的表达均明显抑制细胞增殖。升高的FAM83B引起MAPK和mTOR信号通路活化,对靶向治疗耐药,相应的信号通路抑制剂:MEK(U0126),mTOR(rapamycin)和c-Raf(RAF kinase inhibitor I)可抑制FAM83介导的细胞增殖[13]。亚克隆分析表明DUF1669结构域是FAM83B与c-Raf结合,进而介导细胞恶性转化所必需的[14]。因此推测FAM83其他家族成员也具有相似作用。

目前,FAM83E基因在恶性肿瘤中的作用机制尚未见报道。磷酸化是蛋白质翻译后修饰的重要方式,生化实验中常通过基因定点突变Ser为丙氨酸(相关位点不能被磷酸化)模拟去磷酸化状态,将Ser突变为天冬氨酸或谷氨酸(利用其PO4基团的负电荷效应而更易磷酸化)模拟过磷酸化状态。因此,我们推测,FAM83E突变(p.Ser387Gly)(丝氨酸突变为谷氨酸),促使该蛋白自身活化,进而持续激活下游MAPK/ERK和AKT/mTOR信号通路,促进BC和OC发生发展。后续值得进一步开展实验研究,深化理解BC和OC发病机制,可望发现新型驱动基因及潜在治疗靶点。

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