HIF-1α在喉鳞癌组织芯片中的表达及临床意义

冯　彦,孟亚萍,雒红霞,白　玮,张　森,王斌全1,

(1山西医科大学护理学院五官科护理教研室,太原　030001;2山西医科大学第一临床医学院耳鼻咽喉头颈外科;3山西医科大学公共卫生学院;4山西省肿瘤医院病理科;*通讯作者,E-mail:wbq-xy@sxent.org)

喉癌是最常见的呼吸道恶性肿瘤之一。男性发病率远高于女性,以喉鳞状细胞癌最为常见。据报道,确诊喉癌时60%的患者已为晚期[1]。美国癌症协会统计,1975-1977年喉癌患者5年相对存活率为66%,而2005-2011年喉癌患者5年相对存活率为63%[2],尽管对喉癌的治疗方法不断改进，但是喉癌患者的5年相对存活率并未明显提高。喉癌的治疗在过去的几十年中虽然有很大的进展,但由于喉功能的特殊性,在治疗时除生存率外,需要尤为考虑喉的发音、呼吸及吞咽功能。因此,很有必要继续对喉癌进行深入研究。

缺氧现象是实体瘤的重要特征,缺氧不仅可触发机体产生一系列应急性保护反应,还与肿瘤细胞的一些生物学行为密切相关,例如:侵袭、转移、血管生成及细胞凋亡。缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是1992年Semenza和Wang首先发现的一种存在于人和哺乳动物细胞内转录调控因子。HIF-1是由一个α亚基(HIF-1α)和一个β亚基(HIF-1β)组成的异源二聚体蛋白。HIF-1α是介导细胞对缺氧微环境进行适应性反应的关键性转录调控因子。

本研究中,我们将采用免疫组化的方法检测喉鳞癌组织中HIF-1α的表达,探讨HIF-1α与喉鳞癌的临床病理学特征及预后、转移的关系,及其在喉癌病程中的重要作用,为喉癌的诊断治疗提供一定的参考。

1　资料与方法

1.1　临床资料

共收集138例山西省肿瘤医院2006-03～2008-12手术切除和病理确诊的喉鳞状细胞癌患者,平均年龄58.50岁。其中,男性132例,女性6例。纳入患者术前均未行放化疗,且均为首次手术。经山西医科大学医学伦理委员会同意后进行标本取材,知情同意书由患者本人或家属签署。

1.2　方法

1.2.1制作组织芯片收集138例喉鳞癌组织蜡块,首先进行苏木精-伊红染色切片,并进行形态学观察,同时在蜡块上找到对应点作出标记。使用组织芯片阵列仪,从定位的目标石蜡块上钻取组织,将所取组织转移到空白石蜡的相应位置,54 ℃恒温箱加热,使组织芯片和受体蜡块相互融合,4 μm切片,制作成5块5×6组织芯片。138例喉鳞癌患者中选取喉鳞癌癌旁正常组织32例。

1.2.2HIF-1α免疫组织化学染色HIF-1α鼠抗人单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司,PV-9000通用型二步法免疫组织化学检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;DAB试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司。操作严格按试剂盒说明书进行。

1.2.3结果判定HIF-1α在细胞核和细胞浆中表达,胞浆中可见棕黄色的较大颗粒,细胞核周围表达明显,少量位于细胞核内。对细胞浆和核中棕色颗粒的细胞进行分析。

细胞浆核出现均匀一致的棕黄色颗粒为阳性信号。每张切片随机取3个高倍视野,以阳性细胞比例的平均值定义为该肿瘤的阳性细胞百分比。按标准判断:阳性细胞数<10%为“-”;10%-25%为“+”;26%-75%为“++”;>75%为“+++”。以(+)-(+++)为阳性表达标准。

1.2.4统计分析采用SPSS15.0统计学软件进行统计学分析,计数资料以例(%)表示,采用Fisher确切概率法或卡方检验进行组间比较,检验水准α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　喉鳞癌病例的临床病理资料及芯片有效性

将138例喉鳞癌患者的组织蜡块均制成每例5块5×6组织芯片蜡块。其中,9例组织因未取到鳞癌组织或者所取鳞癌组织很少而无法进行有效分析,由于实验中7例组织掉片,最终芯片中可以进行有效分析的组织共122例(见表1)。其中,男性116例,女性6例,年龄38-79岁,平均年龄59岁。声门上型患者78例(63.9%),声门型21例(17.2%),声门下型3例(24.6%),由于资料不全,20例患者(16.4%)临床分型不确定。T1期患者10例(8.2%),T2期患者33例(27%),T3期患者66例(54.1%),T4期患者13例(10.7%)。33例患者(27.0%)有淋巴结转移,80例患者(65.6%)确诊时均无远处转移,9例患者(7.4%)资料不全无法确定是否淋巴结转移。

2.2　免疫组化法检测HIF-1α蛋白

HIF-1α蛋白在喉鳞状细胞癌组织中的阳性表达,主要在细胞浆和细胞核中表达,呈黄色或棕黄色(见图1)。

A.阳性表达(×40)　 　　　B.高表达(×100)图1　HIF-1α在喉鳞癌组织中的表达Figure 1　Expression of HIF-1α in laryngeal squamous cell carcinoma

本研究122例喉鳞癌患者中HIF-1α蛋白阳性表达率为62.3%(76/122)。32例喉癌癌旁正常组织中HIF-1α蛋白阳性表达率为9.4%(3/32)。喉鳞癌组织中HIF-1α蛋白阳性表达率明显高于癌旁正常组织,且两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。卡方检验结果显示:HIF-1α蛋白表达与喉鳞癌组织TNM分期及淋巴转移显著相关(P<0.05),即在TNM分期较晚以及有淋巴结转移的患者中,HIF-1α蛋白呈现高表达。而与喉癌患者的年龄、性别及病变位置均无关(P>0.05,见表1)。

表1喉鳞癌中HIF-1α蛋白表达与临床病理参数的关系

Table1RelationshipbetweenclinicopathologiccharacteristicandHIF-1αproteinexpressioninlaryngealsquamouscellcarcinoma

临床病理参数nHIF-1α阳性阴性χ2P年龄0.1790.672 <60岁644123 ≥60岁583523性别0.05130.821 男性1167244 女性642临床分型0.919650.631 声门上型784731 声门型21138 声门下型312T分期9.2710.0023 T1+T2431924 T3+T4795722淋巴结转移17.5442.81×10-5 无804238 有33312

3　讨论

喉癌是耳鼻喉科最常见的恶性肿瘤之一,喉部位置特殊、解剖复杂、功能重要、存在3个胚叶组织,这些都增加了对喉鳞癌治疗的复杂性。尽管喉癌治疗方法在不断改进,但喉癌患者的生存率与生存质量仍不理想。目前对喉癌的发生、发展、浸润及淋巴结转移的分子生物学机制仍不清楚,仍需要更加深入地研究和了解。

组织芯片,又称组织微阵列(tissue microarray,TMA),是一种近年来兴起的病理技术,它将数十个、数百个乃至上千个小的组织片整齐地排列在某一载体上而成的缩微组织切片。在一张组织芯片切片上可高通量获取组织学、基因和蛋白表达的信息。组织芯片具有高效、快速、低消耗、自身内对照和可比性强的特点。组织芯片的应用范围广,可作为一种大样本的研究工具进行相关研究,如免疫组织化学、原位杂交、荧光原位杂交等,为基因表达的检测、疾病早期诊断、药物的筛选等提供高通量有效的方法。

血管生成在肿瘤发生、发展、侵袭及转移中起重要作用。低氧诱导因子-1α(HIF-1α)是细胞在缺氧条件下产生的具有转录活性的核蛋白,在肿瘤新生血管生成中起一定的促进作用。近年来低氧诱导因子-1α(HIF-1α)在恶性肿瘤中的研究作用受到广泛关注,已有研究[3,4]证实,在乳腺癌、宫颈癌、食管癌等实体瘤中HIF-1α呈过度表达,且HIF-1α过度表达可能与患者不良预后相关。HIF-1α在喉癌发生、发展、浸润及远处转移中的相关研究仍很有限且存在争议。

2016年张卫平等[5]对喉癌组织中HIF-1α的表达与临床意义进行了系统评价,研究中作者全面系统检索国内外发表的相关文献,发现共5篇[6-10]相关研究,其中喉癌组织202例,正常癌旁组织75例。研究结果显示:HIF-1α蛋白在喉癌组织中表达较其在正常组织中表达高,在有淋巴结转移的喉癌组织中的表达较在无淋巴结转移的喉癌组织中表达高,中低分化喉癌组织中HIF-1α蛋白的表达较高分化的喉癌组织明显增高;临床Ⅲ-Ⅳ期喉癌患者喉癌组织中HIF-1α蛋白的表达较Ⅰ-Ⅱ期喉癌患者喉癌组织中HIF-1α表达明显增高。提示HIF-1α蛋白的表达与喉癌的发生、淋巴结转移、肿瘤分级及临床分期密切相关。同时研究者指出:有关HIF-1α在喉癌组织中表达的相关文献及样本量均较少,仍需进一步扩大样本量与更优的研究设计方案来证实HIF-1α与喉癌发生、发展及预后的关系,以便寻找抗喉癌药物新的治疗靶点。

本研究采用组织芯片技术对138例喉鳞癌组织进行HIF-1α蛋白免疫组织化学检测。结果发现HIF-1α蛋白在喉癌旁细胞中的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.05);伴随着喉癌患者淋巴结转移的出现和TNM分期越高,HIF-1α阳性表达也越高。HIF-1α阳性表达与肿瘤位置、患者年龄、性别无关(P>0.05)。与已有相关研究结果一致[5-10]。

综上所述,在喉鳞癌发生、发展及侵袭转移过程中HIF-1α具有重要作用,对喉鳞癌组织中HIF-1α的表达情况进行检测,可作为判断喉鳞状细胞癌生物学行为的参考指标之一。

参考文献：

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[5]张卫平,王莹.喉癌组织中HIF-1α的表达及临床意义[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2016,30(23):1892-1895.

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