SLC12A5在结直肠癌中的表达及其临床意义

王晓元,李曙光*,赵轶峰,杨永江,武雪亮,李　坤,王金科，彭　涛

(1河北北方学院附属第一医院胃肠肿瘤外科,张家口　075000;2河北北方学院附属第一医院病理科;*通讯作者,E-mail:shuguangli6688@126.com)

1　材料与方法

1.1　病例资料

收集2016-09～2017-01河北北方学院附属第一医院胃肠肿瘤外科手术切除的结直肠癌组织40例和癌旁正常组织40例,癌组织取自癌灶中心处,癌旁组织取自残端切缘经病理证实为正常肠组织。全部病例均为原发性肿瘤,且术前未行新辅助放化疗等针对性治疗,术后标本均在手术切除组织后1 h获得,并存于液氮中。

1.2　主要试剂与实验方法

1.2.1主要试剂兔抗人单克隆浓缩型SLC12A5抗体,购于香港abcam公司;兔抗人GAPDH多克隆一抗、羊抗兔二抗,购于美国Santa Crue公司;DAB显色剂购于上海Gene Tech公司。总RNA提取试剂、反转录试剂盒、SDS-PAGE标准指示剂、RIPA试剂、BCA蛋白定量试剂盒、引物均购自美国Life Technologies公司。

1.2.2RT-PCR法检测SLC12A5 mRNA表达提取并测定总RNA浓度,设计SLC12A5上游引物:5′-GCAGGAGCCATGTACATCCT-3′,下游引物:5′-CCATGCAGGTGAGCACACA-3′;GAPDH上游引物:5′-GGAGATTGTTGCCATCAACG-3′,下游引物:5′-TTGGTGGTGCAGGATGCATT-3′;反应体系:1×PCR Buffer 2.5 μl,dNTP 0.5 μl,cDNA模板2 μl,Taq酶1.25 U,上下游引物各1 μl,RNA 酶抑制剂1 μl,反应总体积25 μl。根据试剂盒说明书操作进行扩增:以1 μl DNA样本作为模板,以去离子水为阴性对照模板;扩增条件为95 ℃预变性2 min;95 ℃10 s,退火温度15 s,72 ℃延伸45 s,共35个循环;最后72 ℃再延伸10 min。产物于2%琼脂糖凝胶后电泳分离,于紫外线灯下观察结果。

1.2.3Western blot法检测SLC12A5蛋白表达提取总蛋白并定量,取50 μg蛋白,置入5×缓冲液(4 ∶1),100 ℃水浴,5 min 3次,8% SDS-PAGE电泳,后转至PVDF膜,取出膜,加5%脱脂奶粉封闭,弃封闭液滴加特异性一抗-4 ℃孵育过夜,加TBST洗涤液,滴加特异性二抗(1 ∶1 500)37 ℃孵育1 h,再次加入TBST洗涤液,ECL法检测条带,进行密度定量分析。

1.2.4免疫组织化学染色检测SLC12A5蛋白表达10%甲醛溶液固定标本,石蜡包埋,切片4 μm,苏木精-伊红染色,病理诊断。切片经80 ℃烤箱烤片30 min,乙醇脱水,灭活内源性过氧化物酶,枸橼酸缓冲液高温高压水化修复;PBS洗3次,加一抗(1 ∶100)50 μl,4 ℃过夜;PBS洗3次,加二抗50 μl。室温下DAB显色,PBS洗3次,苏木精轻度复染,盐酸乙醇分化,流水冲洗10 min,梯度乙醇脱水,松节油透明,树胶封片,阴性对照为PBS代替一抗,光镜下观察。

SLC12A5阳性表达的判定:阳性染色主要集中于细胞质中,少量表达于细胞核,为棕黄色或褐色颗粒,计算阳性细胞百分比并评分,≤5%为0分,6%-25%为1分,26%-50%时为2分,51%-75%时为3分,>75%时为4分;无着色:0分,浅黄色:1分,黄色:2分,深黄色:3分。两者相乘,0分为(-),1-4分为(+),5-8分为(++),9-12分为(+++),(+)-(+++)均视为阳性。

1.2.5统计学方法应用SPSS17.0统计软件分析,计数资料以百分率表示,运用χ2检验表示 SLC12A5的表达与临床病理参数之间的关系,设α=0.05为检验水准。

徐州市中心城区分为12个片区，其中老城片区、坝山片区、云龙湖周边片区、南部片区为优化提升区，以传统商业形态为主；北部片区、西部片区、铜山片区、机场片区、新城片区、高铁生态商务片区为鼓励发展区，商业综合体布局为主；高新技术产业区、金山桥片区为限制发展区，商业布局缺乏。

2　结果

2.1　SLC12A5的RT-PCR检测结果

以SLC12A5/GAPDH 比值作为RT-PCR定量分析指标,癌组织中SLC12A5 mRNA 的表达水平(0.98±0.04)明显高于结直肠正常组织(0.18±0.03),差异具有统计学意义(P=0.008,见图1)。

图1　RT-PCR检测结直肠癌及正常肠黏膜组织SLC12A5 mRNA的表达Figure 1　Expression level of SLC12A5 mRNA in colorectal adenocarcinoma and normal colorectal tissues detected by reverse-transcription polymerase chain reaction

2 2　SLC12A5的Western blot检测

以SLC12A5/GAPDH比值做蛋白定量检测指标,SLC12A5蛋白在结直肠癌组织中的表达水平亦较结直肠正常组织高(0.86±0.05vs0.15±0.02),差异具有统计学意义(P=0.017,见图2)。

图2　Western blot印迹法检测结直肠癌及癌旁正常黏膜组织SLC12A5蛋白的表达Figure 2　Expression level of SLC12A5 protein in colorectal adenocarcinoma and normal colorectal tissues detected by Western blot

2.3　SLC12A5的免疫组化检测

SLC12A5在结直肠癌组织组阳性表达率是87.50%(35/40),明显高于癌旁正常黏膜的32.50%(13/40),差异具有统计学意义(χ2=16.27,P=0.000,见图3及表1)。

2.4　SLC12A5蛋白与临床病理参数之间的关系

SLC12A5蛋白的表达水平与患者年龄、肿瘤大小、分化程度无关,而在有无肿瘤浆膜浸润、有无肝转移、有无淋巴结转移、不同肿瘤TNM分期、有无脉管浸润中表达差异有统计学意义(P<0.01,见表2)。

A. 结直肠正常组织　 　B. 结直肠癌组织图3　免疫组化检测结直肠组织中SLC12A5蛋白的表达 (×200)Figure 3　Expression level of SLC12A5 protein in colorectal adenocarcinoma and normal colorectal tissues detected by immunohistochemistry (×200)

表1SLC12A5蛋白在结直肠癌组织及正常组织中的表达(例)

Table1ExpressionofSLC12A5proteinincolorectaladenocarcinomaandnormalcolorectaltissues(cases)

组别nSLC12A5-++++++ χ2 P癌组 4056111816.2750.000正常组4027733

3　讨论

SLC12A5是溶质载体家族12亚组中的重要成员之一,定位于人染色体20q13.12,这是人类多种恶性肿瘤最常见的扩增区[6]。SLC12A5最初是作为一种跨膜氯化钾转运体被发现的,这种转运体可以维持神经元内外氯平衡,因而最初对SLC12A5的研究仅局限于癫痫等神经系统疾病[7]。而近年来研究发现SLC12A5突变或异常表达参与某些实体瘤的发生发展[8]。Yu等[9]通过单细胞测序研究发现突变型SLC12A5在大肠癌患者中呈高表达,而在正常人群中呈低频表达,因而表明突变型SLC12A5在大肠癌中有潜在的致癌作用。Xu等[10]通过基因测序、基因扩增技术发现SLC12A5与原发性大肠癌的发生密切相关,其能显著促进细胞增殖,诱导细胞周期G1过渡,增强其侵袭、迁移能力。SLC12A5抗凋亡的作用是通过抑制凋亡诱导因子和核酸内切酶G-依赖的凋亡信号通路介导的;而促转移作用是通过调节基质体系结构的关键要素,包括基质金属蛋白酶和纤维连接蛋白等[11]。进一步研究显示SLC12A5的过表达与大肠癌患者生存期显著下降关系密切。Liu等[12]通过实时定量逆转录聚合酶链反应检测癌细胞系、蛋白免疫印迹和免疫组织化学法检测SLC12A5在膀胱肿瘤中的表达,发现SLC12A5表达在膀胱肿瘤组织中表达明显增加,SLC12A5表达与肿瘤淋巴结、血行转移显著相关。Kaplan Meier生存曲线显示高SLC12A5表达与膀胱肿瘤患者预后不良相关,且是患者生存的独立预后指标,考虑SLC12A5可能作为调节NF-κB信号通路和促进MMP-7增殖的重要因子,促进膀胱肿瘤转移,增强其恶性生物学行为。

表2SLC12A5在结直肠癌组织中的表达及与相关临床病理指标的关系(例)

Table2ExpressionofSLC12A5proteinincolorectaladenocarcinomatissuesanditscorrelationwithclinicalpathologicalfeatures(cases)

病理参数nSLC12A5-+阳性率(%)χ2P年龄0.0650.975 ≥60岁2231986.36 <60岁1821688.89肿瘤大小0.0830.781 ≥5cm2632388.46 <5cm1421285.71分化程度0.0710.962 高92775.00 中1821671.43 低1321170.59浆膜浸润8.9540.002 有3423294.12 无63350.00TNM分期7.0970.008 Ⅰ+Ⅱ83562.50 Ⅲ+Ⅳ3223093.75淋巴结转移8.2510.006 有2412395.83 无1641275.00肝转移6.3330.016 有909100.00 无3152683.87脉管浸润4.0970.041 有11011100.00 无2952482.76

本研究通过RT-PCR检测发现SLC12A5 mRNA 在结直肠癌中的表达水平明显高于结直肠正常组织,表明SLC12A5 mRNA在结直肠癌组织中广泛表达,而在正常黏膜组织中其表达沉默或下调;应用Western blot法检测发现SLC12A5蛋白在结直肠癌组织中的表达水平亦较结直肠正常组织高,免疫组化发现SLC12A5在结直肠癌组织中的阳性表达率明显高于正常组织,表明SLC12A5过表达在结直肠癌癌变过程中发挥关键的促进作用,SLC12A5是一种促进结直肠癌发生和发展的致癌基因。

深入研究发现,结直肠癌伴浆膜浸润者较未侵及浆膜者SLC12A5蛋白表达明显增高;伴肝转移、淋巴结转移、脉管浸润者较无转移浸润者SLC12A5蛋白表达明显增高;TNM分期越高,SLC12A5蛋白表达也越高,表明SLC12A5蛋白表达水平与结直肠肿瘤的恶性生物学行为密切相关,对结直肠癌的侵袭、转移有促进作用。

综上所述,SLC12A5的异常表达与结直肠癌的发生、发展及其恶性生物学行为具有高度的相关性,因而SLC12A5有望成为新的肿瘤监测指标,为临床诊治及预后监测提供重要的参考。本实验仅对SLC12A5在结直肠癌中的表达及与临床病理特征的关系做出了相关研究,但对其致癌机制、作用通路尚有待研究。

参考文献：

[1]黄秋驰,叶丁,蒋曦依,等.人群结直肠癌筛检项目成本效果分析与评价[J].中华流行病学杂志,2017,38(1):65-68.

[2]张俊,许春伟,张博.通过单细胞测序发现结肠癌双系起源的新型癌基因-SLC12A5[J].临床与实验病理学杂志,2014,30(12):1332-1334.

[3]Tao R,Li C,Newburn EN,etal. Transcript-specific associations of SLC12A5 (KCC2) in human prefrontal cortex with development, schizophrenia, and affective disorders[J].J Neurosci,2012,32(15):5216-5222.

[4]Saito T,Ishii A,Sugai K,etal. A de novo missense mutation in SLC12A5 found in a compound heterozygote patient with epilepsy of infancy with migrating focal seizures[J].Clin Genet,2017,11(5):2241-2252.

[5]Kursan S,McMillen TS,Beesetty P,etal.The neuronal K(+)Cl(-) co-transporter 2 (Slc12a5) modulates insulin secretion[J].Sci Rep,2017,7(1):1732-1740.

[6]Doshina A,Gourgue F,Onizuka M,etal.Cortical cells reveal APP as a new player in the regulation of GABAergic neurotransmission[J].Sci Rep,2017,7(1):370-381.

[7]Merner ND,Chandler MR,Bourassa C,etal.Regulatory domain or CpG site variation in SLC12A5,encoding the chloride transporter KCC2, in human autism and schizophrenia[J].Front Cell Neurosci,2015,9:386-395.

[8]Kursan S,McMillen TS,Beesetty P,etal.The neuronal K(+)Cl(-) co-transporter 2 (Slc12a5) modulates insulin secretion[J].Sci Rep,2017,7(1):1732-1739.

[9]Yu C,Yu J,Yao X,etal.Discovery of biclonal origin and a novel oncogene SLC12A5 in colon cancer by single-cell sequencing[J].Cell Res,2014,24(6):701-712.

[10]Xu LX,Li XX,Cai MY,etal.Increased expression of Solute carrier family 12 member 5 via gene amplification contributes to tumour progression and metastasis and associates with poor survival in colorectal cancer[J].Gut,2016,65(4):635-646.

[11]Caner Genome Atlas Network.Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal caner[J].Nature, 2012,487(11):330-337.

[12]Liu JY,Dai YB,Li X,etal.Solute carrier family 12 member 5 promotes tumor invasion/metastasis of bladder urothelial carcinoma by enhancing NF-kappaB/MMP-7 signaling pathway[J].Cell Death Dis,2017,8(3):e2691.