红托竹荪腐烂病初探*

卢颖颖，桂 阳，陈娅娅，曾令祥，朱国胜**

（1.贵州省农业科学院贵州省农作物品种资源研究所，贵州 贵阳 550006；2.贵州省农业科学院贵州省现代农业发展研究所，贵州 贵阳 550006）

红托竹荪（Dictyophora rubrovolvataM.Zang,et al.）隶属于担子菌门（Basidiomycota）腹菌纲（Gasteromycetes） 鬼笔目 （Phallales） 鬼笔科 （Phallaceae） 竹荪属（Dictyophora）。红托竹荪是竹荪中的珍品，药食两用真菌，具有很好的开发前景[1]。红托竹荪在贵州的人工种植面积日益增加，近年来红托竹荪腐烂病病害普遍发生，对红托竹荪产量造成严重的影响。笔者通过对贵州红托竹荪的几个主栽地区发生病害的种植大棚调查发现，其典型症状是初期形成水渍状斑点，后期整个菌蛋腐烂不能正常出菇或形成畸形菇，一旦发病，整个大棚都会发病，减产甚至绝收，给红托竹荪生产造成很大的损失。

目前已报道的食用菌腐烂病多数是细菌性病害或真菌性病害，如糙皮侧耳褐腐病，据其不同发病类型其病原菌有菌盖疣孢霉（Mycogone perniciosaMagn.）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosaMigula）、树枝状轮指孢霉 （Dactylium dendroides）和半裸链孢霉（Fusarium semitectum）；金针菇黑腐病其病原菌为托拉氏假单胞菌（Pseudomonas tolaasii）；刺芹侧耳软腐病其病原菌为欧文氏菌属（Erwiniasp.）[4-6]。针对红托竹荪腐烂病国内许多专家进行了许多有价值的研究和探讨[1-3]，主要集中在研究引起该病的病原菌、虫害、病害等方面，但尚未明确引起该病的具体原因。为明确红托竹荪腐烂病发病原因，笔者在贵州省织金县和黔西南州安龙县的红托竹荪生产基地，对红托竹荪腐烂病的发病程度和发病规律进行调查，同时采集病害样本，对该病害进行发病原因的初步分析，研究结果如下。

1　材料与方法

1.1　病害情况调查

贵州省织金县和黔西南州安龙县皆为我国红托竹荪主产区，也是红托竹荪的传统种植区。菌蛋期指竹荪生长初期未成熟的时期。

病症：病害一般从菌蛋开始感染，初期菌蛋表面出现黄色至淡红色的水珠；中期菌蛋基部便出现针眼状的孔，继而开始腐烂；后期出现感染其他杂菌的现象，如绿霉等。如果尖顶期菌蛋发病，仍可出菇开伞，畸形或部分腐烂。

1.2　样本采集

从贵州省农作物品种资源研究所实验菇房、黔西南布依族苗族自治州安龙县龙广镇小场坝村农望种植农民专业合作社红托竹荪种植大棚、织金县红托竹荪种植大棚分别采集了3组带有水渍斑点的子实体样本，至实验室进行病原菌研究。

1.3　疑似病原物的分离和观察

1.3.1疑似病原物分离培养

（1）病斑处细菌的分离

在采集的3组样品中每组取3个患病子实体，在病斑处进行细菌分离。用75%的酒精棉球，擦拭菌蛋表面进行消毒，把菌蛋沿病斑边缘掰开，将表皮组织用灭菌的镊子和解剖刀移除，然后分别钩取约6 mm2的病变胶质组织和内部组织（尚未分离开的菌柄和菌盖组织），置于装有500μL灭菌水的EP管（离心管）中，用灭菌的玻璃棒将组织研碎混匀，放置10 min，使用灭菌的接种环蘸取混合液在牛肉蛋白胨培养基上划线接种，25℃恒温培养。

（2） 病斑处真菌的分离

在采集的3组样品中每组取3个患病子实体，在病斑处进行细菌分离。用灭过菌的接种钩，挑取菌蛋病斑处的附生真菌菌丝，置于PDA平板培养基上，25℃培养，观察菌落的生长情况。

1.3.2显微镜观察

在采集的3组样品中每组取3个患病子实体，分别取病变组织和未病变组织进行显微观察；在显微镜100×物镜视野下观察组织形态特征；将组织切片放在载玻片上加1滴水，盖盖玻片轻按，在显微镜40×物镜下检查是否有细菌浑浊液；将组织切片移走，浑浊液通过酒精灯火焰固定，革兰氏染色法观察。

1.4　分子鉴定

挑取纯化后的细菌菌体，离心后置于离心管中，加入裂解液，震荡后置于65℃中温浴裂解，提取DNA，使用通用引物SR/SF扩增16S rDNA片段。PCR反应体系为30μL，其中10×PCR缓冲液3μL，dNTP（10mM） 3μL，正向和反向引物（100mmol·L-1）各1.5μL，TapDNA聚合酶1.2μL，模板DNA 3μL。PCR反应程序为94℃预变性300 s；94℃变性30 s，52℃退火 45 s，72℃延伸 60 s，33 个循环；72℃延伸600 s。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR产物由上海英骏生物技术有限公司测序。利用16S rDNA的通用扩增引物[7]（SF：5’-A GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，SR：5’-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3’） 进行PCR扩增。

将测得的序列进行编辑，去掉序列两端的引物，拼接后获得16S rDNA序列。利用ClustalX软件对获得的16S rDNA序列进行比对，序列相似比在99%以上的菌株分为一组。取每组的16S rDNA序列与NCBI数据库进行BLAST比对，同源性较高（至少相似比在90%以上）的菌株作为参照对象，利用软件Mega7邻接法（Neighbor Joining） 构建系统发育树。

1.5　疑似病原物致病性检测

以红托竹荪常规栽培种作为样本，选取疑似病原物的优势菌株进行致病性检测。用接种针挑取少许纯化的优势菌株，直接穿刺在直径4 cm～5 cm健康菌蛋表面接种，每个优势菌株接种5个竹荪蛋。培育温度在28℃～30℃，环境湿度保持在90%以下，常规管理，观察发病情况。

2　结果与分析

2.1　发病情况

通过研究发现，在安龙县和织金县调查的3个菇棚中，腐烂病病害的发病率达到60%～80%。该病害主要发生在7月～9月，发病期菇棚内的温度在32℃～35℃。病斑产生在菌蛋表面，起初为淡黄色水珠，水珠消失留下水印，后期各种杂菌感染逐渐腐烂。

2.2　发病特征

红托竹荪栽培过程中，腐烂病多发生在菌蛋期，发病初期，其症状为菌蛋菌皮表面有淡红色水渍状斑点，可看到斑点上凝结小水珠，中期水珠消失，水渍状斑点变大至直径为0.5 cm～2 cm，斑点颜色变为暗红色，后期斑点处可看到感染各种杂菌，出现白色或绿色菌斑。球形期的菌蛋发病，最终整个菌蛋腐烂而不能正常出菇，尖顶期发病的菌蛋仍可出菇，但菇体部分腐烂或为畸形菇。如图1所示。

图1　红托竹荪腐烂病症状Fig.1　Typical symptoms of the Dictyophora rubrovolvata rot disease

2.3　显微镜观察结果

显微镜观察病斑组织成絮状，且菌皮下的发病胶质层组织有解体腐烂的现象。病斑组织切片，在显微镜低倍视野下，可以看到有浑浊的细菌液，革兰氏染色发现，存在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌菌体。

2.4　病变组织块分离结果

分离培养的病变组织为菌蛋的胶状层，从外观看病变胶质层组织已经出现组织解体现象，用接种钩在无菌操作下钩取病变胶质层组织至PDA培养基上培养，24 h后发现有细菌菌落生长，2 d后仍未发现病变组织萌发。用接种环蘸取少量细菌菌体至LB培养基上，划线涂布培养获得单菌落，菌落形态与吸取的病斑上水珠培养的细菌菌落形态及病变菌皮培养获得细菌菌落形态一致。

2.5　附生菌株初步鉴定

在所采集的3组样品中，通过培养观察挑取了13个优势菌株，利用引物SR/SF扩增16S rDNA片段大约为0.7 kb～1.5 kb。利用软件MEGA中Align方法对测序序列进行比对分析，采用MEGA软件对比对结果进行聚类分析见图2。

图2　序列比对结果Fig.2　Sequence comparison results

根据聚类结果分别挑选序列1-S、J1、T12、2-B、B11、J21、B12、J11在NCBI网站上进行Blast比对，根据比对结果选择相似值达到99%以上的模式菌株序列，模式菌株序列号分别为：KT291174、KY681833、KX822678、 KY780237、 LN564012、GQ306158、KY753321和KX131107。利用软件MegAlign中ClustalW方法对所获得序列进行比对、聚类分析，利用软件Mega7.0构建系统发育树，如图3所示。

从图3可看出，所分离的疑似病原菌菌株主要与芽孢杆菌属 （Bacillussp.，KT291174、KY753321）细菌、肠杆菌属（Enterobactersp.，KY681833） 细菌和伯克霍尔德菌属（Burkholderiasp.，GQ306158）细菌相类似，可基本确定所分离出的优势细菌主要属于这三类细菌。这三个属的细菌为自然界土壤、空气、水等环境中普遍存在的细菌。

图3　分离菌株与NCBI数据库中模式菌株比对结果Fig.3　Comparison results of isolated strainswithmodel strains in NCBIdatabase

通过对所分离出的13个细菌进行革兰氏染色，发现上述三类细菌的3个代表菌株B11、J2、B1分别属于革兰氏阴性菌（肠杆菌属Enterobactersp.）、革兰氏阳性菌（芽孢杆菌属Bacillussp.）和革兰氏阴性菌（伯克霍尔德菌属Burkholderiasp.）。

2.6　致病性检测结果

疑似病原物致病性检测，通过回接试验共接种了B1、J2等13个疑似病原菌，观察均未发现水渍状斑点。

3　讨论

红托竹荪腐烂病主要对子实体的外观和产量造成严重影响，导致红托竹荪收益损失严重。本课题研究主要从安龙县、织金县的种植大棚以及贵阳的出菇大棚采集患病菌蛋样本，通过显微观察和分离培养水渍状病变组织内的细菌，分离到的优势菌在回接试验中均未表现出致病性。

红托竹荪大棚栽培一般是在7月～9月份出菇，该病害主要发生在出菇期，且为大棚出菇病害，林下或仿野生种植并不发生此病害，大棚种植在夏季易形成高温、高湿环境，初步推断红托竹荪腐烂病症状的发生与出菇时温度、湿度有关，还需进一步研究验证。

杏鲍菇细菌性病害，在病斑处产生脓液。平菇和双孢蘑菇细菌性褐斑病等细菌性病害，在潮湿情况下，子实体的病斑处均有细菌脓液产生，且伴有难闻气味。在红托竹荪腐烂病菌蛋表面的水渍状斑点形成和发展过程中，斑点表面未发现明显的细菌性脓液。且取水渍状斑点表皮组织进行培养，在PDA培养基上可以正常萌发，其菌丝形态与正常子实体组织的菌丝形态无明显差异，说明水渍状病变组织未发生坏死。

真菌菌丝细胞壁表面的疏水蛋白（hydrophobin）可利用其疏水作用来维持子实体内的空气通道（air channels） 和菌丝间空隙[9-13]。文献报道裂褶菌（Schizophyllum commune） 的疏水蛋白基因sc4被敲除后，可引起裂褶菌子实体的空气通道充水而呈水渍状[11]；脉孢菌（Neurospora crassa）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans） 和稻瘟病菌 （Magnaporthe grisea） 的疏水蛋白基因 Eas[15]、rodA[14]和 Mpg[13]被敲除后，均导致分生孢子囊或气生菌丝呈现水渍状[8-15]。红托竹荪腐烂病的水渍状斑点的表征与敲除掉疏水蛋白基因的症状类似，该病的发生可能与疏水蛋白基因的调控表达有关。需进一步深入研究红托竹荪腐烂病水渍状斑点的形成与红托竹荪子实体疏水蛋白基因表达调控规律的关系。

本研究尚未对该病害进行原生生物和病毒等相关研究，暂不能确定红托竹荪腐烂病与原生生物和病毒的关系。

参考文献：

[1]潘高潮，龙汉武，吴迪，等.贵州省红托竹荪菌蛋烂皮病的发生与防治[J].中国食用菌，2015，34（5）：72-75.

[2]桑维钧，张颖，柴儒东，等.竹荪球大面积腐烂原因分析及防治对策初探[J].食用菌，2000（5）：40-41.

[3]桑维钧，宋宝安，练启仙，等.竹荪球腐烂致病真菌种类鉴定与药剂筛选 [J].西南农业大学学报：自然科学版，2006，28（2）：302-304.

[4]支月娥，黄建春，汪毅，等.杏鲍菇细菌性病害病原菌研究[J].食用菌，2009，31（2）：23-24.

[5]张瑞颖，胡丹丹，左雪梅，等.平菇和双孢蘑菇细菌性褐斑病研究进展[J].植物保护学报，2007，34（5）：549-554.

[6]张瑞颖，左雪梅，姜瑞波.平菇褐斑病病原菌的分离与鉴定[J].中国食用菌，2007，26(5)：58-60.

[7]Stackebrandt E,Goodfellow M.Nucleic acid techniques in bacterial system atics[M].New York:John Wiley and Sons,1991:115-175.

[8]张瑞颖，胡丹丹，左雪梅，等.白灵侧耳水渍状斑点病初探[J].食用菌学报，2012，19（2）：106-110.

[9]Lugones LG,Wsten HAB,Birkenkamp KU,et al.Hydrophobins line air channels in fruiting bodies ofSchizophyllum communeandAgaricus bisporus[J].Mycol Res,1999,103(5):635-640.

[10]Lugones LG,Bosscher JS,Schol-tmeyerk,etal.An abundant hydrophobin(ABH1)forms hydrophobic rodlet layers inA－garicus bisporusfruiting bodies[J].Microbiology,1996,142(5):1321-1329.

[11]Van Wetter M-A,Wsten HAB,Wessels JGH.SC3 and SC4 hydrophobins havedistinct roles in formation of aerial structures in dikaryons ofSchizophyllum commune[J].Molecular Microbiol,2000,36(1):201-210.

[12]Banerjee G,Robertson DL,Leonard TJ.Hydrophobins Sc3 and Sc4 gene expression in mounds,fruiting bodies and vegetative hyphae ofSchizophyllum commune[J].Fungal Gen Biol,2008,45(3):171-179.

[13]Talbot NJ,Ebbole DJ,Hamer JE.Identification and characterization of MPG1,a gene involved in pathogenicity from the rice blast fungusMagnaporthe grisea[J].The Plant Cell Online,1993,5(11):1575-1590.

[14]Stringer MA,Dean RA,Sewall TC,et al.Rodletless,a newAspergillusdevelopmentalmutant induced by directed gene inactivation[J].Genes Dev,1991,5(7):1161-1171.

[15]Bell-Pedersen D,Dunlap JC,Loros JJ.The Neurospora circadian clock-comtrolled gene,ccg-2,is allelic to eas and encodes a fungal hydrophobin required for formation of the conidial rodlet layer[J].Genes Dev,1992,6(12):2382-2394.