泛素连接酶Cbl⁃b基因短发卡RNA慢病毒载体构建及其对A375细胞生物学行为的影响

王小坡　倪娜娜　熊竞舒　宋昊　姜祎群　陈浩　曾学思　孙建方210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所病理科

Casitas B⁃lineage lymphoma（Cbl）⁃b是泛素连接酶Cbl家族成员之一，Cbl⁃b干扰能增强获得性（T细胞）和先天性（自然杀伤细胞）抗肿瘤免疫效应［1⁃2］。Ito等［3］研究发现，Cbl⁃b在胃癌组织中高表达，且与胃癌侵袭及淋巴结转移相关。Nam等［4］研究发现，在乳腺癌细胞系MDA⁃MB⁃231中应用siRNA抑制Cbl⁃b表达或敲除Cbl⁃b基因后，MDA⁃MB⁃231细胞丧失降解基质的活性，其浸润活性受到显著抑制。Qu等［5⁃6］研究发现，紫草素诱导肺癌细胞凋亡与Cbl⁃b蛋白抑制ERK信号通路和负性调节PI3K/AKT信号通路有关。我们前期研究发现，黑素瘤组织及细胞株均高表达Cbl⁃b蛋白，并且Cbl⁃b表达水平与黑素瘤进展、Clark分级和Breslow厚度均呈正相关，推测Cbl⁃b可能作为癌基因参与黑素瘤发病过程［7］。为进一步验证该设想，我们构建Cbl⁃b shRNA慢病毒载体，探讨其对黑素瘤A375细胞增殖、凋亡、细胞周期及侵袭等生物学行为的影响。

材料与方法

一、主要试剂与细胞

DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（美国Gibco公司），DNA限制性内切酶（AgeI、EcoRI）、T4 DNA连接酶（立陶宛MBI Fermentas公司），RNAi⁃Mate转染试剂、慢病毒载体pGLVU6/Puro和包装质粒（上海吉玛公司），DNA凝胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司），质粒中量抽提试剂盒（杭州爱思进生物技术有限公司），Cbl⁃b鼠单克隆抗体（sc⁃8006）（美国Santa Cruz公司），Transwell小室（美国Corning公司），反转录试剂盒（美国Promega公司），实时荧光定量PCR试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司），细胞计数试剂盒8（CCK8，日本同仁公司），凝聚胺（美国Sigma公司），异硫氰酸荧光素-膜联蛋白V/碘化丙锭（Annexin V⁃FITC/PI）凋亡检测试剂盒（美国ADL公司）。

大肠杆菌感受态细胞JM 109（上海吉玛公司），A375细胞系（中国医学科学院皮肤病研究所中心实验室保存），293T细胞株（中国科学院细胞库）。

二、试验方法

1.Cbl⁃b shRNA慢病毒载体设计和构建：从GenBank中获取人Cbl⁃b mRNA的完整序列（NM_001321786.1），利用Designer3.0软件设计3条靶向Cbl⁃b基因的shRNA 序列即 CBLB⁃shRNA⁃1（5′⁃GCCTGGATCTAATTCAGAAAG⁃3′）、CBLB⁃shRNA⁃2（5′⁃GCAAGTGGCCAAGTTCCTTTG ⁃3′）、CBLB ⁃shRNA⁃3（5′⁃GGAACACATGGTCCATCTTCA⁃3′）及1条阴性对照（5′⁃TTCTCCGAACGTGTCACGT⁃3′）序列，Blast分析表明以上4条序列均不与人其他任何cDNA序列同源。根据以上4段序列分别设计合成4对寡核苷酸序列，每对包含1条正义链和1条反义链。引物由上海吉玛公司合成，退火后配对形成双链DNA。通过T4 DNA连接酶，将双酶切线性化后的慢病毒载体pGLVU6/Puro和双链DNA片段进行连接反应。用连接后的产物转化大肠杆菌感受态细胞JM 109，挑取转化子进行菌落PCR鉴定、测序，质粒抽提试剂盒抽提去内毒素的质粒，-20℃备用。

2.慢病毒包装：转染前24 h接种293T细胞，待细胞达到70%～80%融合时，将重组慢病毒质粒载体 pGLVU6/Puro⁃shRNA 和包装质粒（pGag/Pol、pRev、pVSV⁃G）的DNA混合液与转染试剂RNAi⁃Mate混合，共转染293T细胞。培养72 h后，收集293T细胞上清液，用孔径0.45 μm过滤器过滤，病毒上清液通过超离心浓缩、收集分装，-80℃保存。

3.慢病毒转染A375细胞：将A375细胞按1×104/孔接种于6孔板中，培养24 h后，分别以1×107滴度的 CBLB⁃shRNA⁃1、CBLB⁃shRNA⁃2、CBLB⁃shRNA⁃3及阴性对照病毒转染，加入终浓度为5 mg/L聚凝胺。同时设立转染空载体的空白对照组，37℃5%CO2条件下培养72 h收样。

4.实时荧光定量PCR检测Cbl⁃b mRNA水平：转染后72 h用Trizol提取A375细胞总RNA，按反转录试剂盒说明书合成cDNA，实时荧光定量PCR检测Cbl⁃b mRNA表达水平。Cbl⁃b正向引物5′⁃GATG AATCGGTTGGCAAAC⁃3′，反向引物：5′⁃GGGTGGC AGGCTTAGATG ⁃3′，目的产物 139 bp。内参照3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）正向引物 5′⁃AAATCCCATCACCATCTTCC⁃3′，反向引物：5′⁃ATGACCCTTTTGGCTCCC⁃3′，目的产物 147 bp。PCR扩增条件：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火/延伸30 s，收集每个循环荧光，共40个循环。所有试验重复3次。以2⁃△△Ct值表示Cbl⁃b mRNA相对表达量。

5.Western印迹检测Cbl⁃b蛋白水平：转染后72 h提取A375细胞总蛋白，变性后取等量蛋白50 μg上样，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS⁃PAGE）电泳、转膜，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，分别加入鼠Cbl⁃b单克隆抗体（1∶500）及鼠GAPDH抗体（1∶1 000），4℃摇床振荡孵育过夜。PBS漂洗滤膜4次，每次10 min。将聚偏氟乙烯膜与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（1∶5 000）室温振荡孵育2 h。显影，曝光，成像。用Image J分析软件分析条带灰度，目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

6.CCK8法检测细胞增殖：将转染后72 h的A375细胞以3 × 103个/孔接种于96孔板，每孔100 μl，每组设5个复孔，同时设空白对照组（仅加培养基），分别培养24、48、72、96 h后，倾去培养基，加入新鲜培养基 100 μl，避光加入 CCK8 试剂 10 μl，避光37℃继续培养3 h，以正常对照孔调零，酶标仪450 nm处测各孔吸光度（A值）。

7.流式细胞仪检测细胞凋亡：转染后72 h收集A375细胞，在细胞悬浮液中加入5 μl Annexin V⁃FITC/PI，轻轻混匀后于2～8℃避光孵育15 min，加入10 μl PI，2～ 8℃避光孵育5 min。1 h内用流式细胞仪检测。总凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

8.流式细胞仪检测细胞周期：转染后72 h，胰酶消化细胞，离心沉淀，1 ml预冷的PBS混悬细胞，离心沉淀，加入2 ml预冷75%乙醇，4℃固定24 h，再次离心沉淀，每管加入100 μl PI，4℃避光30 min后，流式细胞仪检测。

9.Transwell检测细胞侵袭能力：采用24孔Transwell系统。小室内加入60 μl基质胶（Matrigel，1∶6稀释），将转染后72 h的A375细胞按1× 103个/孔接种于Transwell小室，下室加入血清浓度为20%的培养液700 μl，37 ℃ 5%CO2条件下培养24 h。擦去小室表面的Matrigel胶，固定，结晶紫染色。显微镜下观察计数，每孔随机选取5个视野，取平均值，每组重复3次。

10.统计学方法：采用SPSS 23.0软件，数据以x±s表示。多组间均数比较采用方差分析，各组随时间变化的趋势采用重复测量因素方差分析，多重比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结　果

一、慢病毒载体的测序鉴定

测序结果证实，3个重组克隆中插入片段序列与所设计的寡核苷酸序列完全一致，慢病毒载体构建成功。

二、Cbl⁃b mRNA干扰效率

慢病毒转染后72 h，CBLB⁃shRNA⁃1组、CBLB⁃shRNA⁃2组、CBLB⁃shRNA⁃3组、阴性对照组、空白对照组的Cbl⁃b mRNA相对表达量分别为0.63±0.05、1.02±0.04、1.04±0.04、0.98±0.04和1.00±0.00（F=67.866，P＜ 0.05）。CBLB⁃shRNA⁃1组与其余各组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），而其余各组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。CBLB⁃shRNA⁃1组干扰效率最好，与空白对照组相比沉默效率为37%。

三、Cbl⁃b蛋白沉默效果

慢病毒转染后72 h，CBLB⁃shRNA⁃1组、CBLB⁃shRNA⁃2组、CBLB⁃shRNA⁃3组、阴性对照组、空白对照组的蛋白相对表达量分别为1.24、0.13、0.00、1.17、1.00（图 1），可见CBLB⁃shRNA⁃2组、CBLB⁃shRNA⁃3组均有一定沉默效果，与空白对照组相比沉默效率分别为87%、100%，选择蛋白沉默效率最高的CBLB⁃shRNA⁃3进行后续试验。

四、干扰Cbl⁃b表达对A375细胞增殖的影响

见图2。阴性对照组、空白对照组和CBLB⁃shRNA⁃3组间细胞增殖能力差异有统计学意义（F组别=12.847，P＜0.01），各组增殖能力随时间延长而增加（F时间=948.73，P＜0.01），组别与时间之间无交互作用（F交互=2.365，P＞0.05）。24、48 h时3组间增殖能力差异均无统计学意义（P＞0.05），而72、96 h时CBLB⁃shRNA⁃3组增殖能力均明显低于阴性对照组和空白对照组（P＜0.01）。

图1　慢病毒转染A375细胞72 h后Cbl⁃b蛋白表达　1：CBLB⁃shRNA⁃1组；2：CBLB⁃shRNA⁃2组；3：CBLB⁃shRNA⁃3组；4：阴性对照组；5：空白对照组

图2　Cbl⁃b干扰对A375细胞增殖的影响　72、96 h时CBLB⁃shRNA⁃3组增殖活性显著低于另2组，P＜0.01

图3　干扰Cbl⁃b表达对黑素瘤A375细胞凋亡的影响　左上象限为死亡细胞，右上象限为晚期凋亡细胞，右下象限为早期凋亡细胞，左下象限为正常活力细胞。CBLB⁃shRNA⁃3组凋亡率显著高于阴性对照组和空白对照组

表1　Cbl⁃b干扰对A375细胞周期分布的影响（%，x±s）

五、干扰Cbl⁃b表达对A375细胞凋亡、细胞周期、细胞侵袭能力的影响

阴性对照、空白对照组和CBLB⁃shRNA⁃3组细胞凋亡率分别为（6.08±1.35）%、（6.34±1.07）%、（22.73±6.58）%，差异有统计学意义（F=17.693，P＜ 0.01）。CBLB⁃shRNA⁃3组凋亡率明显高于阴性对照组和空白对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见图3。

阴性对照、空白对照组和CBLB⁃shRNA⁃3组G1期、S期细胞比例差异均有统计学意义（P＜0.01），而G2期细胞比例差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。CBLB⁃shRNA⁃3组G1期细胞比例高于阴性对照组和空白对照组，而S期细胞比例低于阴性对照组和空白对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

阴性对照、空白对照组和CBLB⁃shRNA⁃3组穿膜细胞数分别为76.60±1.82、73.20±3.83、19.60±1.14，差异有统计学意义（F=794.50，P＜ 0.01）。CBLB⁃shRNA⁃3组穿膜细胞数显著低于阴性对照和空白对照组（P＜0.01）。

讨　论

近年发现，若干基因突变和异常的细胞信号通路参与恶性黑素瘤发生发展，这些发现促进了靶向治疗药物和免疫治疗药物的发展［8］。

RNA干扰（RNAi）技术是指由小片段双链RNA分子介导的生物细胞内同源基因的特异性转录后基因沉默现象。慢病毒介导的RNAi具有转染效率高、可感染分裂细胞和非分裂细胞、目的基因可在宿主细胞中长时间稳定表达以及安全性好等诸多优点［9］。本研究中，我们设计、合成3条针对Cbl⁃b基因的shRNA靶点序列，进行shRNA重组慢病毒表达载体的包装，转染人黑素瘤A375细胞，筛选干扰效果最明显的靶序列。Western印迹显示，CBLB⁃shRNA⁃3蛋白沉默效率最高，但对Cbl⁃b mRNA水平无明显影响，其原因可能是miRNA可以表现出siRNA样作用，而siRNA也可显示出miRNA样作用。有学者认为siRNA表现出miRNA作用是因为siRNA与mRNA碱基未能完全互补，但把这种现象归因于siRNA和靶mRNA之间的碱基互补程度是不确切的［10⁃11］。在siRNA被组装成RNA诱导沉默复合体过程中，若RISC复合体中Ago蛋白具有RNA催化活性（人类4种Ago中仅Ago2具有此活性），可引起靶mRNA降解。有时RISC中的Ago不具有降解靶mRNA催化活性而起到抑制翻译作用［12］。我们设计的CBLB⁃shRNA⁃3可能在细胞内招募了不具有RNA催化活性的Ago家族蛋白，产生了miRNA样作用，即高度互补的shRNA干扰序列靶向mRNA，未产生降解，但抑制mRNA翻译，具体机制尚需要进一步研究。因为生物功能行使是通过蛋白来实现的，所以我们选择蛋白沉默效率最高的CBLB⁃shRNA⁃3进行后续试验。

本研究中我们采用CCK8试验在体外证实Cbl⁃b干扰能够抑制黑素瘤A375细胞的增殖。同时，还证实Cbl⁃b干扰能够使黑素瘤A375细胞周期发生G1期阻滞，并促进细胞凋亡。因此，我们推测Cbl⁃b一方面促进细胞周期转化，加速细胞分裂，产生更多细胞；另一方面通过抑制细胞凋亡，延长细胞存活时间参与黑素瘤的发生发展。在细胞侵袭试验中，Cbl⁃b干扰能使A375细胞进入Transwell小室下层的数目明显小于空白对照组及阴性对照组，说明Cbl⁃b具有促进黑素瘤细胞侵袭的生物学功能。本研究我们仅探讨了沉默黑素瘤A375细胞Cbl⁃b对细胞增殖、细胞周期、细胞侵袭能力等体外肿瘤生物学行为的影响，下一步可利用裸鼠皮下成瘤实验，观察沉默Cbl⁃b在体内对黑素瘤生物学行为的影响，并利用蛋白质组学探讨Cbl⁃b参与黑素瘤发病的可能分子通路机制。

综上所述，Cbl⁃b可能参与黑素瘤的发生发展过程，深入了解Cbl⁃b的促癌机制可能为黑素瘤的治疗提供新思路，针对Cbl⁃b的靶向治疗有望成为黑素瘤治疗的新靶点。

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