褪黑素借下调CDC25A与p21表达及磷酸化抑制人胃癌细胞增殖❋

宋 军 马赛君 罗建华 刘 卉 徐 丽 李 丽 张智广 周瑞祥△

(1 福建医科大学基础医学院消化道恶性肿瘤教育部重点实验室， 福州 350122； 2 福州总医院第二住院部检验科， 福州 350002)

胃癌是导致原发性癌症死亡损失健康生命年(years of life lost，YLL)的第3大原因。2015年全球有130万胃癌病例和81.9万胃癌死亡病例[1]。在中国，胃癌的发病率男性仅次于肺癌排第2，女性胃癌发病率在乳腺癌、肺癌之后排第3，是死亡率最高的几种癌症之一，严重威胁人类健康[2]。褪黑素(melatonin，MLT)又名N乙酰5甲氧色胺，是一种吲哚类神经内分泌激素。研究表明，褪黑素具有抗肿瘤的作用，可以抑制胃癌、肝癌、乳腺癌[3]等多种肿瘤。褪黑素通过促进凋亡，抑制增殖，调节免疫等多种途径发挥抗癌作用，然而其抗癌作用的分子机制尚待明确。本研究选取人胃癌细胞系AGS和MGC803，探讨褪黑素作用后对细胞周期及增殖的影响，并检测与细胞周期及增殖相关蛋白的变化以阐明其抗胃癌作用及分子机制。

1 材料和方法

1.1 细胞和试剂

人胃癌细胞系AGS、MGC803购自上海细胞研究所。采用含10%胎牛血清的RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 及MEM/F12培养液置于CO2培养箱中37℃培养。胎牛血清和培养液购自美国Hyclone公司。褪黑素购自美国Sigma-Aldrich公司，褪黑素溶于无水乙醇中，无水乙醇在培养基中的终浓度不超过1%。CellTiter 96®AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay(MTS)细胞增殖试剂盒购自美国Promega公司；BD PharmingenTMPI/RNase Staining Buffer购自美国BD公司；RIPA细胞强裂解液和BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天公司；蛋白酶抑制剂(cocktail)及蛋白磷酸酶抑制剂(PhosStop)购自瑞士Roche公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自Millipore公司；化学发光检测底物CDP-STAR购自Roche公司；免疫印迹实验(Western blotting)用的特异性抗体，包括CDC25A和磷酸化CDC25A(pCDC25A, phosphor S75)、p21和磷酸化p21(pp21, phosphor T145)抗体以及碱性磷酸酶标记山羊抗兔抗体购自英国Abcam公司；GAPDH购自美国CST公司；碱性磷酸酶标记山羊抗鼠抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2 褪黑素对胃癌细胞增殖作用的影响

采用CellTiter 96®AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay(MTS)细胞增殖试剂盒分析褪黑素作用后细胞的增殖活性来选择合适的作用浓度和作用时间。人胃癌细胞AGS、MGC803以1×104/ml的浓度接种于96孔板中，24 h后用1、2、3、4、5 mmol/L的褪黑素处理，并用加1%无水乙醇的细胞作为阴性对照。分别作用24、48、72 h加入MTS，以不含细胞的培养液做空白对照组，37℃培养箱中孵育2 h后，检测490 nm处的吸光度值来分析细胞的增殖活性。细胞增殖抑制率按如下公式计算：增殖抑制率=[1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。并在倒置显微镜下观察褪黑素处理胃癌细胞状态。

1.3 细胞周期分析

采用碘化丙啶(PI)染色，流式细胞仪分析细胞周期。AGS、MGC803用3 mmol/L褪黑素及处理24 h，以加入1%乙醇的培养细胞作为对照组(control)，胰酶消化制成单细胞悬液，加入PI后用流式细胞仪检测，分析处于G0/G1、S、G2期的细胞百分率。

1.4 免疫印迹检测

褪黑素处理细胞与加入1%乙醇溶剂的对照细胞(control)采用加入蛋白酶抑制剂和磷酸化蛋白质抑制剂的强裂解液裂解，BCA法定量后，加入12%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，三明治法转入PVDF上，0.5%牛血清封闭，加入以下几种一抗4℃孵育过夜：CDC25A(1∶200 稀释)、pCDC25A(phosphor S75，1∶1 000稀释)、p21(p21Cip1/p21Waf1，1∶5 000稀释)、pp21(phosphor Thr145，1∶1 000稀释)和GAPDH(1∶1 000 稀释)。PBS漂洗后加碱性磷酸酶连接的二抗室温孵育1 h，加入化学发光底物CDP STAR，化学发光仪检测目的蛋白。用灰度分析软件Image J2x分析其灰度值变化。褪黑素处理细胞的蛋白质灰度值除以对照细胞蛋白质灰度值计算蛋白质表达水平变化，以此变化倍数为纵坐标做直方图。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 褪黑素作用引起细胞增殖抑制、细胞显微结构变化显著

分别用0、1、2、3、4、5 mmol/L的褪黑素处理AGS、MGC803细胞24、48 h和72 h，MTS试剂盒分析细胞增殖活力。结果显示，褪黑素可抑制AGS、MGC803细胞增殖，具有浓度依赖性(图1)。褪黑素处理浓度及时间以3 mmol/L和24 h为宜，其细胞抑制率在50%左右，浓度过高或时间过长使细胞死亡过多，难以进行后期的试验分析。倒置显微镜观察，3 mmol/L褪黑素处理24 h AGS、MGC803与只加褪黑素溶剂乙醇的对照细胞相比，细胞数量减少，漂浮死亡细胞增多，胞体细长多角，形态出现明显变化(图2)。

2.2 褪黑素作用引起细胞周期阻滞于G1/S期

PI染色流式细胞仪分析细胞周期显示，褪黑素作用引起不同细胞周期细胞的分布发生变化。在AGS细胞中，褪黑素作用组较对照组细胞G0/G1期从50.28%

图1 褪黑素作用人胃癌细胞AGS(A)、MGC803(B)细胞抑制率分析Fig 1 Percentage of cell inhibition in AGS(A) and MGC803(B) treated with melatonin

图2 3 mmol/L褪黑素作用人胃癌细胞24 h的显微镜观察Fig 2 Microscopic examination of human gastric cancer cells treated with 3 mmol/L melatonin for 24 h compared to control cells

±0.31% 上升到67.04%±1.46%(P<0.01)，S期从17.21%±1.22%下降到9.71%±0.58%(P<0.01)，G2/M 期从32.47%±1.12%下降到23.27%±1.91%(P<0.01)。G0/G1期细胞升高，S期和G2/M期细胞下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。在MGC803细胞中，褪黑素作用组较对照组细胞G0/G1期从42.24%±1.27%上升到 47.66%±1.57%(P<0.01)，S期从12.68%±1.13%到 10.03±1.22%(P>0.05)，G2/M 期从44.84%±2.45%到41.88%±0.40%(P>0.05)。G0/G1期细胞升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；S期和G2/M期细胞差异没有统计学意义。2种类型胃癌细胞褪黑素作用细胞周期分析见图3。

2.3 褪黑素对AGS、MGC803细胞CDC25A和p21表达及其磷酸化水平的影响

细胞分裂周期蛋白CDC25A 及细胞周期蛋白激酶抑制蛋白p21其表达及磷酸化水平可调控细胞周期的运行。采用免疫印迹的方法，用相应蛋白的普通抗体及磷酸化抗体对细胞增殖及细胞周期调控相关蛋白CDC25A及p21的表达及磷酸化水平进行了分析，在2种胃癌细胞褪黑素作用后都出现CDC25A及p21表达的下调，相应的CDC25A及p21的磷酸化水平也较对照组降低(图4)。

图3 3 mmol/L褪黑素作用24 h对人胃癌细胞周期的影响Fig 3 Effect of 3 mmol/L melatonin for 24 h on cell cycle of human gastric cancer cells by flow cytometry

图4 褪黑素作用AGS(A、C)、MGC803(B、D)细胞CDC25A(A、B)及p21(C、D)表达及磷酸化水平免疫印迹分析Fig 4 Western blotting analysis of the expression and phosphorylation of CDC25A(A,B) and p21(C,D) in AGS(A,C) and MGC803(B,D) with melatonin

3 讨论

褪黑素是主要由松果体合成并分泌的一种神经内分泌激素。除松果体外，其他组织和器官也合成褪黑素，如纹状体、视网膜、脾、肝和胃肠道等[4]。褪黑素具有多种多样的生理学功能，如：调节日夜节律，抑制生殖系统发育成熟，调节骨骼生长，抑制肿瘤发生，调节免疫，清除自由基抗氧化、抗炎、神经保护等作用[5-6]。褪黑素的抗肿瘤作用是目前褪黑素研究的热点领域，研究表明褪黑素可以通过多种途径抑制多种肿瘤，但是褪黑素作用的分子机制尚不十分明确。褪黑素可以抗胃癌。在胃肠道中，褪黑素的含量远远超过其他组织，是松果体的400倍，比血清中含量高10～100倍。胃肠道组织细胞不仅可以分泌褪黑素，其上还有褪黑素受体，通过自分泌或旁分泌发挥重要的保护和调节作用。研究表明褪黑素可以增强胃肠道的免疫系统，调节粪便水份，减缓肠道蠕动，保护胃肠道免受消化酶、胃酸以及外源性药物的影响[7]。本课题组前期动物实验表明，褪黑素可通过促进凋亡、抑制增殖以及降低肿瘤组织局部CD4+CD25+Treg细胞抗鼠胃癌[8-9]。Li 等[10]研究褪黑素对胃癌细胞AGS的作用，认为其可通过激活JNK和P38和抑制NF-κB途径促进AGS的凋亡。

为了进一步研究褪黑素对人胃癌细胞的作用及其作用的分子机制，本研究采用AGS及MGC803作为体外模型，探索褪黑素对其细胞周期、增殖的影响及相关的细胞内分子机制。研究表明褪黑素可以诱导人胃癌细胞AGS及MGC803细胞周期阻滞在G1/S期，抑制AGS及MGC803增殖。细胞周期调控相关分子CDC25A及p21表达及磷酸化水平下降，是褪黑素引起周期阻滞及增殖抑制的作用分子。

CDC25A(细胞分裂周期25A)是一种重要的细胞周期调控因子，其本身为蛋白磷酸酶，可以使磷酸化的CDK4或CDK6 去磷酸化，从而激活cyclin D-CDK4/ CDK6复合体，驱动细胞周期从G1进入S期。体外研究表明，增殖细胞内微注射CDC25A的抗体，或者下调CDC25A的表达可以使细胞周期阻滞于G1/S期。CDC25A在S75位置上磷酸化可以使其稳定，避免其泛素化降解，推动细胞周期的进行[11]。褪黑素作用后S75位置上的CDC25A磷酸化水平下调，使其趋向泛素化降解，从而抑制细胞周期从G1进入S期。CDC25A在多种恶性肿瘤如胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等中高表达，与不良预后相关。本研究结果显示褪黑素作用MGC803细胞后引起CDC25A表达下调，磷酸化CDC25A(S75)下降促进其分解，提示CDC25A可能是褪黑素诱导MGC803细胞G1/S期周期阻滞，抑制其增殖的关键分子。

p21(p21Cip1/p21Waf1)是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂家族CIP/KIP中的一员，可以激活细胞周期检测点抑制细胞周期运行。由于p21可以与CDC25A的启动子相结合从而抑制其表达，因此CDC25A的抑制曾被认为是在DNA受损的情况下，通过p53上调p21来实现的。但在本研究中显示，p21并不像预期的那样升高而是下降。提示p21对细胞增殖的调控作用除了抑制作用之外还有其他的作用方式。目前已有研究表明，p21有促进细胞分裂的作用。p21可以与cyclin/cdk 形成cyclin/cdk-p21复合物推动细胞周期的进行；Martin等[12]在研究褪黑素抑制C6神经胶质瘤的作用时也显示p21下降的现象。另外，Rother 等[13]研究表明p53家族成员Tap63α和p73α可以上调p21，但不抑制CDC25A表达，说明p53对CDC25A的抑制可以不通过p21，表明p21及CDC25A同时下调是可能的。Zhang 等[14]研究表明，当p21在Thr145上磷酸化时，可以促进其稳定并定位于细胞核，增强肺癌细胞H1299增殖，p21在肿瘤中的作用具有双面性[15]。本研究结果显示褪黑素作用后Thr145位点的磷酸化p21下调，抑制胃癌细胞增殖。

本研究通过分析褪黑素作用人胃癌细胞AGS、MGC803表明：褪黑素下调CDC25A、p21表达及其磷酸化，引起胃癌细胞G1/S期细胞周期阻滞，抑制胃癌细胞增殖，为明确褪黑素抑制胃癌的分子机制提供了理论基础。