血清与全反式维甲酸对神经干细胞分化及突起生长的作用差异❋

赵海霞 任丽伊 左 璇 李云竹 李淑蓉 苏炳银△

(成都医学院， 1 发育与再生四川省重点实验室，>2 人体解剖与组织胚胎学教研室， 3 病理学与病理生理学教研室， 成都 610500)

神经干细胞(neural stem cells, NSCs)是一群具有自我增殖和分化潜能的细胞，可修复和替代神经退行性疾病中受损的神经细胞，重建细胞环路和功能，随着神经干细胞研究的迅速发展，为神经退行性疾病的治疗提供了新的途径[1-2]。 NSCs[1]经各级神经前体细胞，可分化为成熟的神经细胞和神经胶质细胞[3]。因此，调控NSCs定向分化是目前应用于治疗的关键。目前，用于NSCs分化模型建立的主要诱导方式是血清和全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid, RA)诱导，本研究拟利用血清和RA分别诱导从胚胎小鼠分离并培养的NSCs，比较两者对NSCs的分化以及神经元突起生长的作用差异，为NSCs分化机制研究的模型选择提供基础实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级C57雌性和雄性小鼠(2～3个月年龄)购于成都达硕实验动物有限公司。

1.2 主要试剂

小鼠单克隆抗体nestin(ab6142)和小鼠单克隆抗体Map2(ab11267)、兔多克隆抗体GFAP(ab7260)购自Abcam公司；594标记的山羊抗小鼠IgG荧光二抗和488标记的羊抗兔IgG荧光二抗488购自Invitrogene公司；DMEM/F12(1∶1)基本培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗溶液、Accutase酶、B27、GlutaMax、Heparin购自Gibco公司；碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和表皮生长因子(epithelial growth factor, EGF)购自PeproTech公司； RA、多聚赖氨酸(poly-D-lysine, PDL)购自Sigma公司；DAPI封片剂购自中杉金桥生物技术公司。

1.3 NSCs分离和培养

将2～3月龄发情期的雌性小鼠与雄性小鼠交配过夜，次日早晨检栓阳性的小鼠为妊娠期0.5 d。收集胚龄E12.5 d的胎鼠，分离脑皮质组织，并用Accutase酶在37℃处理10 min，同时用枪轻轻吹打，使组织解离成单细胞，然后通过40 μm细胞筛滤过。细胞悬液以 1 000 r/min离心5 min，去上清。加入NSCs培养基重悬细胞沉淀，以2105 cells/ml的密度接种到培养板中，置于37℃、5% CO2培养箱中进行培养。每3 d半量换液[3]，6～7 d后收集增殖形成的神经球，消化成单细胞，进行传代培养。NSCs培养基成分：DMEM/F12、1%青霉素-链霉素双抗溶液、1% GlutaMax、2 μg/ml Heparin、2% B27、20 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF。

1.4 NSCs诱导分化

收集传代培养2～3代的神经球，消化成单细胞，以2×105cells/ml的密度接种到已用PDL包被的24孔培养板中，并加入诱导分化培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中进行培养3 d或者7 d。每3 d换液1次。诱导分化培养基：DMEM/F12、1%青霉素-链霉素双抗溶液、1% GlutaMax、2 μg/ml Heparin、2% B27、2%血清或者1 μmol/L RA。

1.5 免疫荧光染色

将24孔培养板中的分化培养基吸出，加入预冷的PBS轻轻清洗1次，然后用4%多聚甲醛于室温固定30 min。PBS洗涤3次，封闭液(含10%羊血清和0.3% Triton X-100)室温封闭1 h，一抗(1∶200)4℃孵育过夜。二抗(1∶400)室温孵育1 h。加入DAPI封片剂，荧光显微镜观察并拍照。

对于神经球的免疫荧光染色，需提前将培养6～7 d的神经球接种到PDL包被的培养板中，贴壁2～3 h。方法同前，用4%多聚甲醛固定，进行抗体孵育、荧光显微镜观察并拍照。

1.6 图像定量分析

使用Adobe Photoshop图像处理软件计数免疫荧光染色阳性的细胞数目和DAPI染色的总细胞数目，分析免疫荧光染色阳性的细胞数目占DAPI染色的总细胞数目的百分比。其中在每个时间点，每个诱导组含5个生物学重复，每个重复在荧光显微镜下拍摄3个区域用于计数。使用Image-Pro Plus(IPP)图像处理分析软件测量Map2阳性的神经元突起的数目，以及突起的长度。其中在每个时间点，每个诱导组含5个生物学重复，每个重复分别统计60个Map2阳性的神经元的突起数目，并测量60个突起的长度。

1, 7 统计学处理

2 结果

2.1 NSCs培养及鉴定

E12.5 d的胎鼠脑皮质组织被解离成单细胞后，在NSCs培养基中培养。2 d后，原代培养的NSCs增殖，可见4～6个细胞聚集在一起(图1A，见封底)；4 d后，NSCs增殖形成约50 μm直径的神经球(图1B，见封底)；6 d后，NSCs增殖形成约100 μm直径的神经球(图1C，见封底)。原代培养的神经球收集后，重新消化成单细胞传代培养，6～7 d后NSCs再次增殖形成神经球。将传代3次后形成的神经球，用免疫荧光检测NSCs的标记分子nestin的表达。检测显示神经球中的细胞为nestin阳性的NSCs(图1D-F，见封底)。

2.2 血清和RA诱导对神经元分化的影响

神经球传代3次后，消化成单细胞，接种于PDL包被的24孔培养板中，分别用血清诱导培养基和RA诱导培养基诱导NSCs 3 d或7 d。诱导3 d后，NSCs可分化为神经元，并能被神经元标记分子Map2所标记(图2，见封底)。统计分析显示，诱导3 d后，RA诱导组中Map2阳性细胞占总细胞的比例显著高于血清诱导组(P<0.01)(图4A)。诱导7 d后，免疫荧光检测显示仍有Map2阳性的神经元(图3)，RA诱导组中的Map2阳性的细胞占总细胞的比例仍显著高于血清诱导组(P<0.01)(图4A)。但是随着诱导时间的延长，Map2阳性的神经元所占比例在血清诱导组中显著降低(P<0.05)，在RA诱导组中没有明显变化(图4A)。

2.3 血清和RA诱导对星形胶质细胞分化的影响

血清诱导培养基和RA诱导培养基不仅能诱导NSCs分化为神经元，也能分化为星形胶质细胞，并被星形胶质细胞的标记分子GFAP所标记(图2-3，见封底)。免疫荧光检测显示诱导3 d或7 d后，血清诱导组中GFAP阳性的星形胶质细胞占总细胞的比例都显著高于RA诱导组(P<0.01和P<0.01)(图4B)。与诱导3 d相比，血清诱导组和RA诱导组中的GFAP阳性的星形胶质细胞所占的比例在诱导7 d后，都进一步显著升高(P<0.01)(图4B)。

进一步观察星形胶质细胞的形态显示，血清诱导组和RA诱导组中的胶质细胞形态差异较大。诱导分化3 d，血清诱导组的星形胶质细胞胞体较大，突起较短，呈原浆型，而RA诱导组中胶质细胞胞体较小，呈卵圆型，突起较长，但突起数目较少，呈放射性胶质细胞样(radial glia-like)形态(图2，见封底)；诱导分化7 d，血清诱导组的星形胶质细胞仍呈原浆型(protoplasmic-like)，而RA诱导组中的胶质细胞胞体变大，突起明显增多，较细，并且突起末端较膨大(图3，见封底)。

图4 血清和RA诱导对NSCs分化的影响Fig 4 The effects of serum and RA treatments on the differentiation of neural stem cells in vitro

2.4 血清和RA诱导对神经元突起生长的影响

为检测血清和RA诱导对神经元突起生长的影响，本研究首先统计分析了诱导分化3 d及7 d后神经元突起的长度。结果显示，诱导分化3 d后，RA诱导组中的神经元突起长度与血清诱导组中的没有差异，但是诱导7 d后，RA诱导组的突起长度明显长于血清诱导组(P<0.01)(图5A)。不仅如此，与诱导分化3 d相比，血清诱导组中神经元突起的长度在诱导7 d后没有明显变化，但是RA诱导组中的神经元突起长度在诱导 7 d 后显著增长(P<0.01)(图5A)。

进一步分析诱导分化神经元突起的数目显示，诱导分化3 d后，RA诱导组的神经元突起数目比血清诱导组少(P<0.01)，但是诱导分化7 d后，RA诱导组的突起数目明显比血清诱导组多(P<0.01)(图5B)。另外，结果显示，随着诱导时间的延长，RA诱导组和血清诱导组中的突起数目都明显增加(P<0.05和P<0.01)(图5B)。

图5 血清和RA诱导对神经元突起生长的影响Fig 5 The effects of serum and RA treatments on the neurite outgrowth in vitro

3 讨论

NSCs由于其具有自我增殖和多向分化的能力，自Reynolds等[4]于1992年从成年小鼠纹状体分离后，便成为理论研究和临床应用的热点之一。NSCs的分化受到许多基因的有序调控，但目前这些基因的作用机制并未完全阐明。因此，许多研究利用RA诱导或血清诱导NSCs分化模型探讨NSCs的分化机制，为相关疾病的治疗提供理论基础。

血清含有多种营养成分，包括许多生长因子、激素等， 常被用作诱导因子诱导细胞分化。NSCs在血清培养基中，能先后分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞[5]。已有研究表明血清浓度对NSCs分化为神经元或者胶质细胞有影响，低浓度血清有利于NSCs向神经元方向的分化[6-7]。RA作为维生素A的代谢中间产物，在脑发育及神经再生中具有重要作用，其可维持HRas蛋白的稳定性，从而促进NSCs向神经元方向的分化[8-9]。尽管如此，而高浓度的RA也会导致脑发育异常，胚胎畸形，主要认为是RA异常激活了胚胎发育中相关基因的表达及功能。在体外培养中，研究显示RA可通过调节RARs以及PPARβ/δ(过氧化物酶体增殖物激活受体β/δ)促进神经干细胞的分化，常作为诱导因子诱导NSCs、胚胎干细胞等分化为神经元，并且其在诱导分化模型中常用的浓度为1 μmol/L[10]。因此，本研究进一步比较了低浓度的血清(2%)和 1 μmol/L 浓度的RA对NSCs的分化以及对神经元突起生长的影响。

本研究表明RA比血清更易诱导NSCs分化为神经元。无论是短期诱导3 d，或者长期诱导7 d，RA诱导组中的神经元的比例明显比血清诱导组更高。不仅如此，在诱导NSCs分化过程中，RA诱导NSCs分化为神经元的持续周期更长。随着诱导时间从3 d延长至7 d，血清诱导组中的神经元比例显著降低，而RA诱导组中神经元比例变化不明显。在神经修复中，不仅需要提高损伤处的神经元的数目，也需要增强神经元的网络连接功能，因此，神经元的突起的生长是神经功能修复的关键之一[1]。Dmetrichuk等[11]的研究表明RA可诱导非脊椎动物静水椎实螺的神经元突起的生长。Chu等[12]的研究进一步证实并且RA能促进脊椎动物大鼠的NSCs衍生而来的神经元突起的生长。在比较血清和RA对诱导生成的神经元的突起生长的影响研究中显示，RA更利于促进神经元突起的生长。短期诱导形成的神经元突起的长度在两者之间没有差异，但是在长期诱导后，RA显著提高了突起的长度以及神经元突起的数目。另外，在短期诱导中显示，RA诱导的突起的数目比血清诱导的少，尽管如此，诱导时间延长后，RA诱导的突起数目明显增加，推测可能是RA比血清促进神经元成熟的时期稍晚。

已有报道证实RA不仅能诱导NSCs分化为神经元，也能诱导胶质细胞的产生[13]。本研究显示血清和RA诱导的胶质细胞的分化具有时间依赖性，随着时间的延长，两者诱导的胶质细胞的比例都不断增加。尽管如此，血清更易诱导NSCs分化为胶质细胞。相较于RA诱导组，血清诱导组中的胶质细胞的比例更高。 另外，本研究结果显示血清和RA诱导的胶质细胞形态不一致。其中，在诱导3 d后，RA诱导形成的胶质细胞具有放射性胶质细胞的形态特征，而血清中的胶质细胞形态呈原浆型胶质细胞形态。已有研究表明放射性胶质细胞具有分化神经元的潜能[14-15]。因此，推测RA在早期诱导形成的胶质细胞并未完全分化成成熟的星形胶质细胞，该细胞可进一步分化为部分神经元，利于维持在诱导后期的较高水平的神经元的比例。