脱细胞猪小肠黏膜下层的组织相容性❋

王付燕 杜立群

(山东大学齐鲁医院眼科， 济南 250012)

组织工程技术的发展为再生医学及组织器官的修复重建提供了新的研究思路，理想的支架材料是组织工程研究及临床应用的基础，来源于天然组织或器官的细胞外基质能为细胞的黏附、生长、增殖和分化提供最为接近自然的微环境，其用做组织工程支架材料越来越受到研究者的重视[1-3]。取自猪空肠的小肠黏膜下层(small intestinal submucosa，SIS)本质为不含细胞的天然细胞外基质材料，具有良好的生物相容性、一定的机械强度以及低免疫原性等优点，现已被广泛用于组织工程腹壁、膀胱和角膜上皮等组织器官的修复重建[4-6]。脱细胞生物支架可有效降低移植后免疫排斥反应，并能很好维持原有细胞外基质的结构和功能[7]。为更加深入了解脱细胞SIS异体移植的可行性，本研究应用0.1%十二烷基磺酸钠(SDS) 脱细胞处理猪SIS，SD大鼠皮下埋植组织学观察脱细胞SIS的组织相容性，为其作为组织工程支架材料修复组织损伤及进行临床移植的可行性提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物和分组

新鲜猪小肠由济南农家土猪肉食品有限公司提供(雌雄均可，约6月龄，体质量约100 kg)。

雄性SD大鼠(4周龄，体质量180～220 g)18只，购于济南腾利经贸有限公司。随机分为2组，每组9只，分别为正常SIS移植组和脱细胞SIS移植组。各组大鼠均在清洁恒温恒湿环境中饲养。

1.2 脱细胞SIS的制备

获取新鲜猪小肠，充分冲洗肠内容物，超净工作台内无菌PBS(含200 U/ml双抗)浸泡；机械剥离获取黏膜下层，无菌PBS(含200 U/ml双抗)冲洗；4℃条件下，0.1% SDS处理30 min；无菌PBS反复清洗；-20℃保存备用。

1.3 H-E、DAPI、天狼星红染色观察SIS生物学特性

随机选取正常SIS和脱细胞SIS标本各5个常规石蜡包埋切片，分别行H-E、DAPI及天狼星红染色，组织学观察比较脱细胞前后SIS支架材料细胞、DNA成分残留、组织结构保留及胶原纤维的排列情况。

1.4 SD大鼠皮下埋植

SD大鼠10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，俯卧位固定于手术台。背部剃毛，局部3%碘酒消毒，铺无菌洞巾。于背部正中作长约1 cm纵行切口，切开皮肤全层至深筋膜，钝性分离皮肤及皮下组织做成 1 cm×1 cm 的囊袋，将无菌处理的正常及脱细胞SIS植片分别平铺于2组大鼠背部囊袋中。各组均用3-0丝线缝合皮肤切口。大体观察术后大鼠的活动、进食以及伤口情况等。并与术后1、2、4周各组均麻醉处死3只大鼠，将囊袋的植片完整取出，4%甲醛溶液浸泡固定，标本常规石蜡包埋切片，行H-E染色分析观察埋植物及周围炎症细胞的浸润分布情况。移植后各时间段炎症细胞的数量主要是通过计算机图像分析系统Image-Pro Plus(IPP) software(Media Cybernetics, Bethesda, MD) 计算获得。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 正常及脱细胞SIS的大体形态及组织学观察(图1，见封二)

正常SIS在湿润状态下为乳白色菲薄、半透明的膜状物，并且具有一定的弹性及韧性(图1A)；脱细胞SIS呈白色、半透明的膜状物，稍水肿，保持了良好的弹性及柔韧性(图1E)。H-E染色光学显微镜下观察可见机械刮除的正常猪SIS由整齐有序的胶原纤维排列组成，其组织结构完整，并可见蓝染的细胞和核物质存在(图1B)。脱细胞SIS细胞被完全去除，未见细胞碎片及蓝染核物质残留(图1F)；DAPI染色荧光显微镜下观察可见正常SIS细胞核呈蓝色荧光(图1C)。脱细胞SIS细胞核染色阴性，未见残留的DNA成分(图1G)；天狼星红染色光学显微镜下观察正常猪SIS组织结构完整，胶原纤维排列规则、有序(图1D)。脱细胞SIS胶原纤维排列整齐，结构完整，胶原纤维间孔隙率增大(图1H)。

2.2 SD大鼠皮下埋植实验

大体观察(图2A～C，见封二)：术后观察期间2组SD大鼠饮食、活动均正常，未出现动物死亡情况，未见移植物脱出现象。正常SIS植入组SD大鼠术后l周时创缘轻微裂开，2周时创缘明显红肿、裂开，4周时创缘仍未愈合。脱细胞SIS植入组术后l周时创缘基本愈合，2周时创缘完全愈合，4周时几乎看不清切口(图2D～F，见封二)。

组织学观察(图2G～L，见封二)：术后1周时脱细胞SIS植片形态尚完整，植片周围可见少量以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润，些许淋巴细胞及浆细胞；术后2周时，部分植片开始降解，结构松散，炎症细胞总数明显增多，可见少量巨噬细胞，植片周围出现成纤维细胞；4周时脱细胞SIS植片降解明显，结构更为松散，植片周围炎症细胞数较1、2周时明显减少，其浸润细胞主要为细长的成纤维细胞，并可见少量淋巴细胞浸润。术后整个观察期内正常SIS植片周围均可见广泛的炎症细胞浸润，数目明显多于脱细胞SIS植片组。炎症细胞数定量分析结果显示，术后1周时正常SIS及脱细胞SIS植片炎症细胞的平均密度分别为5 609/mm2和 1 124/mm2(P<0.05)，术后2周时分别为6 186/mm2和 2 045/mm2(P<0.05)， 术后4周时炎症细胞数量明显减少，分别为3 991/mm2和226/mm2(P<0.05)(图3)。术后各时间点2组植片炎症细胞浸润数差异具有统计学意义。

图3 正常及脱细胞SIS植片SD大鼠皮下埋植7、14、28 d炎症细胞平均密度计数Fig 3 Density of inflammatory cells of normal and acellular SIS implanted in the back of SD rats at 7, 14, 28 days

3 讨论

随着组织工程技术的发展，将体外培养扩增的有功能的种子细胞种植于可降解的支架材料上，将其移植到体内损伤部位，随着支架材料的逐步降解，功能性的种子细胞增殖分化为形态、结构、功能与天然组织、器官相似的具有特殊功能的活性组织，其研发有望解决供体材料匮乏的难题[8]。支架材料是组织工程研究领域不可或缺的关键环节，理想的支架材料应当具备以下特点：(1)生物相容性良好；(2)强度大、弹性及柔韧性好，能耐受手术缝线牵拉；(3)体内可降解性，以避免2次手术取出；(4)具有利于细胞黏附、生长的空隙；(5)含有促进细胞黏附、 生长、增殖和分化的细胞因子；(6)来源广泛、取材方便、价格低廉[9-10]。猪与人体具有较相似的解剖学特性，猪的角膜、心、心瓣膜、皮肤等组织器官的脱细胞细胞外基质支架早已广泛应用于组织工程再造的研究[11-14]，并取得良好的效果。猪SIS取自空肠，来源广泛、获取方便、价格低廉，取材不存在伦理方面的问题；具有良好的生物相容性，适当的生物力学性能以及低免疫原性；含有能促进细胞生长分化的细胞因子，比如血管内皮生长因子及转化生长因子-β等[1, 15]。猪SIS的优良生物学特性是其成为理想支架材料的物质基础，相关研究报道美国FDA已批准其用于部分临床组织器官的修复重建[16-17]。

猪来源的SIS带有能够引起宿主移植排斥反应的细胞膜表面抗原及异种DNA物质，高效的脱细胞方法能够完全去除SIS所含异种抗原物质，并完整保留其胶原纤维结构及生长因子等活性物质，为种子细胞的黏附、生长提供适宜的支架[18-19]。以往的研究证明[12, 15]，SDS是目前广泛使用的脱细胞试剂，具有比其他离子型洗涤剂(Triton X-100 和丙酮/乙醇)更强的脱细胞效果，并且在有效去除细胞成分的同时不会对细胞外基质的结构和力学性能造成明显损伤。本研究应用 0.1%浓度的SDS脱细胞处理猪SIS 30 min，组织学观察未见蓝染的细胞及DNA物质残留，同时可见脱细胞细胞外基质支架组织结构完整，胶原纤维排列规则有序，胶原结构完整，胶原间孔隙率增大。

理论上讲，外源性的组织工程支架材料对宿主来说是异物，机体必然要对其产生异物反应。而支架材料的组织相容性对应答的反应程度、炎症消退和修复重建的完成起到决定性的作用。本实验将脱细胞SIS植入SD大鼠背部皮下，通过观察皮肤切口的愈合，植入体内的降解情况及计算炎症细胞的数量来评价脱细胞SIS的组织相容性，并与正常SIS移植SD大鼠做比较。组织学观察结果显示脱细胞SIS在植入初期时结构尚完整，周围可见些许淋巴细胞浸润；中期时植片开始部分降解，组织结构松散，并可见成纤维细胞浸润；随着植入时间的延长，植片降解明显，结构较初始状态更为松散，成纤维细胞变细变长。有研究报道[1, 20]，SIS作为异体移植物植入宿主体内主要诱导辅助性Th2淋巴细胞抑制免疫反应，Th2淋巴细胞主要是通过释放白细胞介素-4、10、13调节宿主的免疫反应，促进宿主对移植材料的耐受以及材料的重塑，是宿主对移植物的正常反应，且Th2淋巴细胞能减弱Th1淋巴细胞促炎性细胞因子的释放。本研究处理的脱细胞SIS中有少量的DNA 残留，但残留量很少，尚不足以引起排斥反应[21]。

总之，制备的脱细胞SIS在植入SD大鼠体内短期内有少量以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，随着植入时间的延长，炎症细胞逐渐减少，成纤维细胞逐渐增多，植片逐渐变薄，结构逐渐松散，表现出良好的组织相容性，为后期进一步的开展临床研究提供了实验基础。