同种异体脱细胞神经支架复合脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子转染骨髓间充质干细胞桥接受损坐骨神经

张雁儒 尚 艳 张戈宸 张 辉

(1 宁波大学医学院， 宁波 315211； 2 郑州市儿童医院检验科， 郑州 450051；3 郑州大学国际教育学院医学实验中心， 郑州 450001； 郑州大学第一附属医院骨科, 郑州 450052)

周围神经的再生受到许多促进以及抑制因素的作用，受损后如果想达到理想的再生，首先必须抑制神经细胞体不可逆的变性，保持其可生长的状态，接着是诱导再生轴突延长并穿过损伤部位，最后一步是轴突生长锥贴近进入靶器官。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)不仅能够维持、调控神经细胞，而且能够促进神经细胞的生长。实验证明，神经损伤能引发立早基因表达, 而某些神经营养因子能阻断这种表达。利用神经营养因子这种较强的促生长作用, 防止或减少周围神经损伤中神经元丧失功能或死亡，促进神经元轴突的再生[1-6]。本研究采用同种异体脱细胞神经支架复合BDNF和CNTF转染骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)纤维蛋白胶桥接术修复周围神经缺损，以期提高实验移植神经的修复质量，改善神经形态学变化。

1 材料和方法

1.1 实验材料、动物和仪器

实验动物 健康杂种犬20只，质量20 kg±4 kg，雌雄不限，(郑州大学动物实验中心提供)动物一般状态良好，皮毛光泽，进食与活动正常，分笼饲养，每笼饲养1只，自由摄食、饮水。大肠杆菌DH5α菌株由郑州大学基础医学院免疫学教研室保存。重组表达载体pIRES-BDNF, pIRES-CNTF和pIRES-BDNF-CNTF(郑州大学基础医学院提供)。普通电子分析天平(日本SANYO公司)，脂质体Lipofect Amine TM2000，质量分数为0.25%胰蛋白酶溶液，胰蛋白酶、EDTA溶液， DMEM培养基购自鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.2 脱细胞异体神经支架制备

将3只健康犬，按剂量(mg/kg)给予速眠新100 mg肌肉注射麻醉，在犬右股内侧作长约10 cm纵行切口，自股内侧肌间隙暴露并切断股动脉，放血处死动物，向内后方牵开股二头肌暴露坐骨神经，切取双侧坐骨神经干，将切取的长7～11 cm犬坐骨神经，按照以下步骤进行萃取处理：(1)浸浴在蒸馏水中12 h；(2)5.0% Triton X-100分解12 h；(3) 再次浸浴在蒸馏水中3 h；(4) 5.0%脱氧胆酸钠分解消化12 h；(5) 循环上述过程；(6)重复完毕再浸入蒸馏水中3 h 。

完成犬坐骨神经的萃取过程后，将其置于温度4℃、pH 7.2的磷酸盐缓冲液中，然后将犬坐骨神经自保存液中取出进行速冻和冷冻干燥。具体操作如下：(1)将萃取的犬坐骨神经进行速冻(放置在铝板上，置于-80℃冰箱中冷冻)；(2)冷冻干燥12 h(温度-56℃，Edwards冷冻干燥机)；(3)分装并辐照灭菌(50拉德γ射线)；(4)保存备用(4℃冰箱)。

经过以上处理的犬脱细胞坐骨神经外观形状良好，经灭菌处理后备用[7-9]。

1.3 转染BDNF和CNTF基因的BMSCs制备。

取2只实验犬的骨髓进行BMSCs的分离、培养。取培养的第3代细胞，采用电转法将重组表达载体pIRES-BDNF、pIRES-CNTF和pIRES-BDNF-CNTF转染至BMSCs。细胞转染后分成5组，采用反转录半定量PCR检测各组BMSCs的BDNF和CNTF基因的mRNA表达水平；采用免疫印迹检测各组BMSCs的BDNF和CNTF蛋白表达水平。

1.4 制备神经缺损动物模型及实验分组

用水合氯醛麻醉15只实验犬，无菌条件下制备缺损8 cm坐骨神经模型。2.5%戊巴比妥钠按照10 mg/kg静脉注射给药，麻醉持续时间2～2.5 h。将麻醉后的犬俯卧位，胶带固定嘴巴及牙齿后将其四肢分开，分别用绷带固定于软木板上，用8%硫化钠脱毛处理后碘伏消毒右后肢及周围15 cm的术野皮肤，并铺巾备用。实验犬均行右后肢体后侧纵行切口，牵开股二头肌，暴露坐骨神经，锐刀离断坐骨神经，并切除一段坐骨神经，造成长约8 cm的神经缺损(图1～4)。各组取相应长度的复合同种异体神经，远断端剪去2 mm，神经断端与移植神经两端长度及直径匹配对合后在显微镜(10倍)下用8/0无损伤缝合线行外膜吻合。肌肉覆盖保护坐骨神经，彻底止血后，用1号丝线缝合关闭伤口，创面2层纱布覆盖，绷带固定。将制成的坐骨神经缺损模型随机分为CEANA+BDNF组、CEANA+CNTF组、CEANA+BDNF+CNTF组、CEANA组(采用8 cm CEANA端端吻合缺损的坐骨神经)、CEANA+BMSCs组。

1.5 观测指标

1.5.1 一般情况 术后犬分笼饲养，手术后8周内要详细观察并记录手术后犬的精神状态、肢体活动、伤口情况和患肢运动功能。术后16周内详细观察并记录犬患足部溃疡形成及愈合情况、患肢体功能的恢复情况及并发症的发生情况。

1.5.2 肌电图检测 术后16周时用2%戊巴比妥钠按40 mg/kg剂量进行腹腔麻醉，暴露并游离右侧移植段坐骨神经及对侧正常坐骨神经，将刺激电极置于近端神经吻合口处，记录电极刺入比目鱼肌，记录犬坐骨神经移植修复术后的神经电生理及比目鱼肌动作电位等情况。检测指标包括：比目鱼肌的动作电位、双侧坐骨神经的运动神经传导速度、双侧坐骨神经的感觉神经传导速度。

1.5.3 H-E染色 术后16周取各实验组坐骨神经移植段，取材分别包含神经近端吻合口以及近远端吻合口以远1 cm，取材后用10%福尔马林常规固定并用石蜡包埋，切片需包含神经吻合口远近端2 mm的范围，采用连续切片法，吻合口处行纵切片，其他部位行横切片。常规H-E染色、髓鞘染色，移植段神经横断切片染色后，计数神经束内轴突，并测量神经束面积，计算轴突密度。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 转染细胞的BDNF和CNTF的mRNA表达

以含有BDNF基因全长cDNA的质粒pCMV-SPORT6-BDNF为模板，使用BDNF基因扩增引物BDNF-Upper Primer 5′ CCTCGAGATGTTCCACCA-GGTGAGAAGAGTGA 3′和BDNF-Lower Primer 5′CACGCGTCTATCTTCCCCTTTTAATGGTCAGT 3′，进行PCR扩增，产物电泳可见788 bp的BDNF目的基因条带，与预期结果一致。

以含有CNTF基因全长cDNA的质粒pCMV-SPORT6-CNTF为模板，使用CNTF基因扩增引物CNTF-Upper Primer 5′ GTCTAGAATGTTCCACCA-GGTGAGAAGAGTGA 3′和CNTF-Lower Primer 5′GGTCGACCTATCTTCCCCTTTTAATGGTCAGT 3′，进行PCR扩增，产物电泳可见611 bp的CNTF目的基因条带，与预期结果一致。

2.2 重组载体pIRES-BDNF、pIRES-CNTF的鉴定

2.2.1 PCR鉴定 BDNF与pIRES、CNTF与pIRES连接后转化在氨苄青霉素LB平板，均长出多个阳性转化菌。各随机挑取2个，分别使用BDNF、CNTF基因扩增引物BDNF-Upper Primer 5′ CCTCGAGATGT-TCCACCAGGTGAGAAGAGTGA 3′和BDNF-Lower Primer 5′CACGCGTCTATCTTCCCCTTTTAATG-GTCAGT 3′、 CNTF-Upper Primer 5′ GTCTAGAA-TGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGA 3′和CNTF-Lower Primer 5′GGTCGACCTATCTTCCCCTTTT-AATGGTCAGT 3′扩增，产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果, 分别判定目的基因BDNF、CNTF基因是否插入， 结果都得到788 bp的BDNF目的基因条带、611 bp的CNTF目的基因条带，初步证实得到重组载体pIRES-BDNF、pIRES-CNTF。

2.2.2 酶切鉴定 对PCR鉴定初步筛选为阳性重组子pIRES-BDNF 、pIRES-CNTF分别提取质粒，分别双酶切再次鉴定。XhoI和MluI双酶切重组质粒pIRES-BDNF，可以得到2个片段，即774 bp目的基因BDNF片段和约6.1 kb的pIRES载体片段，再次证实获得的pIRES-BDNF正确；XbaI和SalI双酶切重组质粒pIRES-CNTF，可以得到2个片段，即597 bp目的基因CNTF片段和约6.1 kb的pIRES载体片段，再次证实获得的pIRES-CNTF正确。

2.2.3 DNA序列测定及分析 对PCR扩增和XhoI 、MluI双酶切鉴定正确的pIRES-BDNF的MCS-A插入序列双向测序后，与GenBank中NM_007540BDNF基因序列进行同源性比较分析，结果与设计完全一致。说明得到正确的重组载体pIRES-BDNF。

对PCR扩增和XbaI和SalI双酶切鉴定正确的pIRES-CNTF的MCS-B插入序列双向测序后，与GenBank中NM_170786CNTF基因序列进行同源性比较分析，结果与设计完全一致，说明得到正确的重组载体pIRES-CNTF。

2.4 重组双基因表达载体pIRES-BDNF-CNTF的构建

2.4.1 双基因重组子的PCR鉴定 CNTF与pIRES-BDNF连接后转化在氨苄青霉素LB平板长出大量的阳性转化菌，随机挑取2个菌落，分别划线保种，并接种含氨苄青霉素液体LB震荡培养，分别提取质粒。使用CNTF基因扩增引物CNTF-Upper Primer 5′ GTCTAGAATGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGA 3′和CNTF-Lower Primer 5′GGTCGACCTATCTTC-CCCTTTTAATGGTCAGT 3′ 扩增1∶100稀释的提取质粒电泳分析PCR扩增结果，可见有611 bp目的基因CNTF, 说明目的基因CNTF插入载体pIRES-BDNF的MCS-B。同时使用BDNF基因扩增引物BDNF-Upper Primer 5′ CCTCGAGATGTTCCACCA-GGTGAGAAGAGTGA 3′和BDNF-Lower Primer 5′CACGCGTCTATCTTCCCCTTTTAATGGTCAGT 3′，扩增，亦可见788 bp目的基因BDNF基因还在载体pIRES上。初步证实得到重组双基因表达载体pIRES-BDNF-CNTF。

2.4.2 双基因重组子的酶切鉴定 在PCR扩增鉴定的基础上，再用XbaI和SalI以及XhoI和MluI同时酶切再次鉴定重组子质粒DNA，酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，可见6.1 kb的载体条带、774 bp BDNF基因条带和597 bp CNTF基因条带。证实得到重组双基因表达载体pIRES-BDNF-CNTF。

2.5 细胞转染

BDNF组(转染重组表达载体pIRES-BDNF)、CNTF组(转染重组表达载体pIRES-CNTF)、BDNF-CNTF组(转染重组双基因表达载体pIRES-BDNF-CNTF)、载体对照组(转染空载体pIRES)的细胞电转24 h后，更换含有 400 μg/ml G418的DMEM培养基进行筛选培养，大约3周，得到稳定转染BMSCs(图1)，遂改用含有200 μg/ml G418的DMEM培养基进行维持培养。

2.6 RT-PCR检测

BDNF组、CNTF组、BDNF-CNTF组、载体对照组和BMSCs对照组的细胞BDNF mRNA相对表达量数值见表1。空白对照组与载体对照组细胞的BDNF mRNA相对表达量差异无统计学意义；BDNF组、BDNF-CNTF组细胞的BDNF mRNA相对表达量与BMSCs对照组的BDNF mRNA相对表达量比较，显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)，说明转染重组表达载体pIRES-BDNF的单基因BDNF表达组细胞和转染重组双基因表达载体pIRES-BDNF-CNTF双基因BDNF-CNTF表达组细胞中的pIRES-BDNF和pIRES-BDNF-CNTF均可高效转录BDNF mRNA。BDNF组、CNTF组、BDNF-CNTF组、载体对照组和MSCs对照组的细胞CNTF mRNA相对表达量数值(表1)显示。空白对照组与载体对照组细胞的CNTF mRNA相对表达量差异无统计学意义；CNTF组、BDNF-CNTF组细胞的CNTF mRNA相对表达量与BMSCs对照组的CNTF mRNA相对表达量比较，均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)，说明转染重组表达载体pIRES-CNTF的CNTF组细胞和转染重组双基因表达载体pIRES-BDNF-CNTF双基因BDNF-CNTF组细胞中的pIRES-CNTF和pIRES-BDNF-CNTF均可高效转录CNTF mRNA。

图1 稳定转染的各组BMSCsFig 1 BMSCs of stable transfection in the each group

表1 各组细胞BDNF和CNTF mRNA相对表达量Tab 1 Relative expression of BDNF and CNTF mRNA in groups

2.7 免疫印迹检测

BDNF组和BDNF-CNTF组BMSCs BDNF蛋白表达很强，而CNTF组、载体对照组和BMSCs对照组细胞BDNF表达弱(图2)。转染说明转染重组载体pIRES-BDNF和pIRES-BDNF-CNTF的BDNF组和BDNF-CNTF组BMSCs中pIRES-BDNF和pIRES-BDNF-CNTF均可高效表达BDNF蛋白。

CNTF组和BDNF-CNTF组BMSCs CNTF蛋白表达很强，而BDNF组、载体对照组和BMSCs对照组细胞CNTF蛋白表达弱(图2)。转染说明转染重组载体pIRES-CNTF和pIRES-BDNF-CNTF的CNTF组和BDNF-CNTF组BMSCs中pIRES-CNTF和pIRES-BDNF-CNTF均可高效表达CNTF蛋白。

由此证实，得到高效单基因BDNF表达BMSCs细胞株、高效单基因CNTF表达BMSCs细胞株和高效双基因BDNF-CNTF表达BMSCs细胞株。

图2 免疫印迹Fig 2 Western blotting

2.8 动物一般情况

各组实验犬在术后2～7周均渐出现手术侧足部红肿、溃疡的发生及跛行，小腿三头肌的力量较差，行走时踝关节不能完全直立。7周后运动功能均有不同程度的恢复；CEANA+BDNF+CNTF组的足部溃疡明显较其他组愈合快，16周后运动功能恢复明显好于其他组。而CEANA组、CEANA+BMSCs组神经再生修复效果不佳，足部及小腿长期红肿、溃疡不愈合。

2.9 移植段神经大体观察

在实验犬术后16周时，用2% 戊巴比妥钠按剂量40 mg/kg进行腹腔麻醉，暴露移植侧坐骨神经，可见CEANA组和CEANA+BMSCs组移植段神经连续性好与周围组织黏连严重，周围局部组织增生形成疤痕，吻合口可触及硬结，神经表面血管化程度差，移植段远近端坐骨神经干变细变硬(图3)。而CEANA+BDNF组、CEANA+CNTF组、CEANA+BDNF+CNTF组移植段神经连续性好，无移植段神经的脱落及分离与周围组织没有硬化性瘢痕黏连，CEANA+BDNF+CNTF组和CEANA+BDNF组相比较移植段神经周围炎性反应不明显，神经表面有明显毛细血管网，两吻合口略膨大，桥接移植段远近端神经干外观基本正常(图4)。

2.10 轴突计数

轴突密度是单位神经束面积内的轴突数目，反映了神经纤维再生情况。CEANA+BDNF+CNTF组轴突密度与CEANA+BDNF组比较差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。提示CEANA+BDNF+CNTF组桥接移植修复犬坐骨神经缺损后更有利于轴突再生、神经纤维的通过及神经功能的恢复。

2.11 肌电图测量及分析

术后16周，CEANA+BDNF+CNTF组实验犬的比目鱼肌诱发电位波幅明显高于CEANA+BDNF组；之后，2组运动诱发电位的潜伏期逐渐缩短，波幅逐渐增高；CEANA+BDNF+CNTF组与CEANA+BDNF组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图4 术后16周CEANA+BDNF+CNTF组移植段神经，图中箭头示吻合口Fig 4 16 weeks after operation, CEANA+BDNF+CNTF group was transplanted with nerve, and the arrow showed anastomosis

术后16周，CEANA+BDNF组和CEANA+CNTF组患侧坐骨神经传导速度无差异，与正常肢体坐骨神经传导速度比较差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 术后16周肌电图及神经传导速度比较Tab 2 Electromyography and nerve conduction velocity at 16 weeks after

3 讨论

在周围神经的再生过程中，微环境有着非常重要的作用，神经营养素在其中发挥了主要作用。大量的实验研究显示，这些可溶性的蛋白因子能够促进某些神经再生相关酶的合成，并且通过抑制神经元的凋亡，从而对神经元的再生、塑形和存活发挥作用。BDNF和CNTF是重要的神经元营养因子, 它能作用于中枢神经元和周围神经元, 不仅能够提高鸡胚感觉神经元体外培养的存活率，而且促进突起的生长[10-16]。

BMSCs是一类非造血的成体干细胞，具有多项分化的能力，能分化成各种细胞，大量的实验证明间充质干细胞能分化为神经元，而且能在体外培养分化表达施万细胞标记物，对周围神经缺损后的再生也有促进作用。大量的细胞免疫学研究表明MSCs具有很低的免疫原性，它只表达主要组织相容性抗原MHCⅠ类分子，不表达MHCⅡ类分子。综上BMSCs有以下优点：来源充足，增殖能力强，免疫抗原性低[17-20]。

本实验显示，使用脱细胞同种异体神经移植修复手术后，手术部位的组织黏连较轻，没有明显的炎症反应，只有很少的瘢痕组织形成，轴突密度很大，神经再生速度和效果都很好，而且比目鱼肌的诱发电位波幅高。化学萃取以后的异体神经抗原性极低，减少了手术后的免疫排斥反应，为神经再生形成理想的微环境，能够引导再生的周围神经轴突从断离神经的近端趋向远端生长，减少神经迷行再生，提高神经通过率，保证再生神经的高选择性支配，更有利于再生神经的生长和功能的恢复。本实验免疫印迹检测结果显示转染的重组载体pIRES-BDNF和pIRES-BDNF-CNTF在神经移植体中正常表达； 其中BDNF+CNTF/BMSCs复合CEANA组和CNTF/BMSCs复合CEANA组的神经移植体CNTF表达很强，显示转染的重组载体pIRES-CNTF和pIRES-BDNF-CNTF在神经移植体中均正常表达。说明把脑源性和睫状神经营养因子注入移植体附近渗透入同种异体脱细胞神经所形成的再生室内后，这些神经营养因子就可以对周围神经的运动神经元起作用，促进神经的再生。实验显示联合应用两种神经因子效果显著优于单独应用其中一种，由此可以推测CNTF+BDNF的共同使用具有协同作用，其具体机制仍需要更深入的研究。