HOTAIR 促进卵巢癌恶性生物学行为❋

董立军 李 岚 宋国军

(1 包头医学院第二附属医院妇产科， 包头 014030； 2 南方医科大学第五附属医院放射科， 广州 510900)

卵巢癌是继宫颈癌和子宫内膜癌的三大恶性肿瘤之一，其病死率高居妇科恶性肿瘤之首，由于起病隐匿、且缺乏行之有效的实验室检测手段, 因此难于早期发现并诊断[1-5]。长链非编码 RNA(long non-coding RNA，lncRNA)因对靶基因表达的调控作用参与了许多癌症发生、发展的过程。前期研究表明，HOTAIR在卵巢癌组织中表达量明显高于正常卵巢组织, 提示可能在卵巢癌的发生、发展中扮演重要的角色。因此本研究拟在前期工作基础上进一步研究HOTAIR在卵巢癌中的作用及其机制, 为HOTAIR在卵巢癌中的作用以及精准治疗提供理论依据和基础。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

人卵巢癌细胞株SKOV3、A2780和OVCAR3由包头医学院第二附属医院妇产科实验室保存。主要试剂：RPMI-1640培养基购自GIBCO公司；胎牛血清、四季血清购自杭州四季青生物材料工程有限公司；青链霉素溶液(双抗)碧云天生物技术研究所胰酶RNA提取试剂盒；DMSO购自 Sigma公司；RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；逆转录试剂盒、PCR试剂盒、HOTAIR引物均购自广州复能基因有限公司。

1.2 研究对象

标本来源于行手术治疗的患者术中切除的新鲜组织，卵巢癌组织(病例组)来源于术前诊断为卵巢癌，术后病理确诊为卵巢癌患者20例，正常卵巢来源于因其他疾病(子宫肌瘤老年患者)行手术治疗，术后病理未提示卵巢癌病变的患者。

1.3 细胞培养

细胞先置于37℃水浴箱里融化复苏，复苏后加入10%血清1%双抗培养基孵育进行细胞传代，取对数生长的细胞。写上细胞类型，时间，冻存者姓名。

1.4 实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)检测HOTAIR mRNA表达

取对数生长期的细胞106个1 ml裂解，加入0.2 ml氯仿分层后取上层无色液相，用异丙醇沉淀其中RNA，用去RNA酶的70%乙醇洗涤沉淀，最后用预热适量的无RNAse的水溶解RNA，取1.5 μl RNA测定浓度和纯度. 融解反应所需要的First Strand Cdna Synthesis Kit中的所有试剂，低速离心机离心混匀。放在冰上备用。按说明书配置RNA-primer Mix 13 μl, 5×RT Reaction Buffer 5 μl, 25 mmol/L dNTP 1 μl, 25 U/μl RNase inhibitor 1 μl, 200 U/μl M-MLV RTase 1 μl, 无酶水4 μl总量25 μl的逆转录反应液。反应结束后，85℃灭活处理5 min，然后用无酶水对反应产物稀释5倍，形成positive cDNA Mix。最后-20℃保存逆转录产物。配置qPCR反应液2×All-in-One qPCR Mix 10 μl, All-in-One qPCR Prime 2 μl, 1ststrand cDNA(5倍稀释液)2 μl，无酶水6 μl总量 20 μl(每个组3个复孔)。混匀后进行qPCR反应，反应条件：预变性95℃ 10 min，变性95℃ 10 s后，进行1个循环，退火60℃ 20 s延伸：72℃ 10 s，进行40个循环反应。运用溶解曲线检测扩增产物的纯度。获得Ct值，采用qPCR相对定量方法对2-ΔΔCt进行统计分析，检测mRNA的表达。

1.5 EdU增殖实验评价卵巢癌株SKOV3的活性

1.5.1 细胞培养 取对数生长期的细胞，按照每孔约 1×105个细胞接种于24孔板中，放入细胞培养箱中，培养至正常生长阶段。

1.5.2 EdU标记 用含有10%胎牛血清的1640培养基按1 000∶1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量的浓度为50 μmol/L EdU培养基。每孔加入200 μl 50 μmol/L EdU培养基，放入细胞培养箱中孵育2 h，然后弃培养基；PBS清洗细胞2次，每次5 min。

1.5.3 固定细胞 每孔加入200 μl含4%多聚甲醛的细胞固定液，室温孵育10 min，然后倾倒固定液。每孔加入200 μl浓度为2 mg/ml的甘氨酸，在摇床上孵育5 min后，倾倒甘氨酸溶液。每孔加入200 μl PBS，脱色摇床清洗5 min，弃去PBS。每孔加入100 μl含 0.5% Triton X-100的PBS，脱色摇床孵育10 min后，PBS清洗2次，每次5min。

1.5.4 Apollo染色 每孔加入200 μl的1×Apollo®染色反应液，于室温下避光孵育30 min后，弃掉染色反应液。加入200 μl含0.5% Triton X-100的PBS作为渗透剂，在脱色摇床清洗3次，每次10 min，弃掉渗透剂。每孔加入100 μl甲醇，在摇床上清洗2次，每次 5 min。PBS再次清洗1次，每次5 min。倾倒PBS液体。

1.5.5 DNA染色 用双蒸水按50∶1的比例稀释试剂F，配制适量1×Hoechst 33342 DNA染色液，然后避光保存。每孔加入200 μl 1×Hoechst 33342 DNA染色液，室温下避光孵育20 min后，弃掉染色反应液。每孔每次加入200 μl PBS清洗3次。

1.5.6 结果分析 在荧光显微镜下拍照，计数，分析结果。

1.6 划痕实验检测卵巢癌株的侵袭转移能力

将6孔板在接种细胞之前先用标记笔在6孔板背面画直线标记。将稳定转染的细胞接种入6孔板，同时加入嘌呤霉素维持筛选。待细胞铺满板底后，用10 μl枪头垂直于孔板划出细胞划痕，尽可能保证各个划痕宽度一致。加入2 ml含无血清培养基，同时在倒置显微镜下拍照，记为0 h的划痕宽度。放于细胞孵箱，48 h后再次拍照。根据收集图片数据分析实验结果。

1.7 Transwell小室侵袭实验检测卵巢癌株的迁移能力

实验前换无血清培养基饥饿处理24 h，用无血清培养基重悬细胞，调节细胞浓度为1×104/ml在每个小室里面加入5×104个细胞，放入细胞培养箱继续培养48 h。将小室取出，用棉签擦除小室里面的细胞，保留小室外侧面的细胞。用4%多聚甲醛固定10 min。苏木精染色10 min，自来水冲洗5 min，将小室放于烤箱中烤干，用刀片沿着小室边缘将膜切下。加1滴中性树胶在干净的载玻片上, 显微镜下随机选择5个视野(上、下、左、右和中)计算细胞的个数。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 qt-PCR检测HOTAIR在卵巢癌细胞株的表达情况

检测卵巢癌细胞株A2780、SKOV3和OVCAR3中HOTAIR mRNA的表达情况。HOTAIR mRNA表达量，SKOV3(6.00±0.41)、OVCAR3(5.60±0.14)分别与A2780(1.80±0.23)比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2 检测SKOV3细胞株的增殖、侵袭、迁移能力

卵巢癌SKOV3细胞株沉默HOTAIR基因后，EdU细胞阳性率明显降低(图1,P<0.05)；卵巢癌SKOV3细胞株沉默HOTAIR后，细胞迁移能力降低(图2,P<0.05)；Transwell小室侵袭实验结果显示, 与对照组比较，卵巢癌SKOV3细胞株沉默HOTAIR后，细胞侵袭能力降低(图3，P<0.05)。

EdU细胞增殖实验显示：与对照组比较，卵巢癌SKOV3细胞株沉默HOTAIR后， EdU细胞阳性率明显降低(图1,P<0.05)。

划痕实验检测沉默HOTAIR后，SKOV3细胞转移能力和对照组比较，SKOV3细胞转染HOTAIR siRNA后，转移能力降低(图2，P<0.05)。

Transwell小室侵袭实验结果显示，与对照组比较， 卵巢癌SKOV3细胞株沉默HOTAIR后， 细胞侵袭能力降低(图3，P<0.05)。

图1 卵巢癌SKOV3细胞对照组(A～C)和沉默HOTAIR后(D～F)EdU检测细胞增殖情况, ×200. A、D：EdU标记；B、E：Hoechst染核；C、F：图像重叠.

3 讨论

本研究结果显示，HOTAIR在卵巢癌SKOV3细胞中表达高于A2780细胞。同时显示，沉默HOTAIR后，卵巢癌SKOV3细胞增殖、转移和侵袭能力均明显受到抑制。这提示HOTAIR可以促进卵巢癌的生长和转移。

HOTAIR可以通过募集PCR2复合体，进而促进组蛋白H3K27的甲基化，从而抑制抑癌基因的表达，然后促进肿瘤的生长和转移[6-8]。Qiu 等[9]研究显示HOTAIR在上皮性卵巢癌组织中的表达增加，并且其升高水平与患者的病理分级、临床分期、总生存期、淋巴结转移以及无病生存期缩短呈正相关。同时研究显示，HOTAIR是上皮性卵巢癌患者预后的1个独立因子。本课题组前期研究通过qPCR检测44例卵巢癌组织及14例正常卵巢组织中HOTAIR的表达情况，显示卵巢癌组织中HOTAIR表达高于正常卵巢组织，病理类型为低度分化及未分化的卵巢癌组织中HOTAIR表达高于中-低、中-高及高度分化组织。提示卵巢癌组织中HOTAIR的表达增高，且癌组织分化越低，HOTAIR 表达越高。提示HOTAIR有可能作为卵巢癌诊断标记物，并可以作为判断其恶性程度的1个分子标志[5]。

本研究结果显示，沉默HOTAIR后，卵巢癌细胞增殖和侵袭能力均降低。有研究报道，沉默HOTAIR后，A2780 和OVCA429细胞增殖能力降低，并且通过干扰细胞周期引起细胞凋亡[9]。Qiu等[9]研究显示，沉默HOTAIR后，可以通过抑制EMT从而抑制卵巢癌的转移。另一项研究表明，过表达HOTAIR可以促进卵巢癌的转移作用[10]。和本研究沉默HOTAIR后抑制卵巢癌转移的结果一致。

综上所述，HOTAIR在卵巢癌的高表达有利于卵巢癌的发生和发展，同时有可能作为1个新的诊断标志。