电针对氯苯丙氨酸致失眠大鼠Toll样受体/核因子-κB信号通路的影响

陈桂容　胡天俊　虞　洁　郭尚函　何扬子

(暨南大学医学院中医系，广东　广州　510632)

失眠是最常见的睡眠障碍，以睡眠的入睡和维持均有困难为特征的，睡眠数量或质量不能满足机体正常需求的一种主观体验〔1〕。长期失眠不利于人的身心健康，容易降低人体免疫功能，引发各个脏腑器官的功能失调，是高血压病、糖尿病、溃疡病、冠心病和某些精神疾病发生的高危因素。针灸以其安全有效无毒副作用的优势，在临床上运用广泛〔2〕。Toll样受体(TLR)/核因子(NF)-κB信号通路在免疫调节中起到了十分重要的作用。TLR/NF-κB信号通路通过诱导NF-κB的转位和促进炎症因子如白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-α、IFN-β等的表达，发挥其在非特异性免疫应答的调节作用。研究表明〔3，4〕，针灸能够提高失眠患者的免疫功能，提高失眠大鼠IL-1、IL-2、IL-6及TNF-α的含量。有研究发现针灸治疗失眠的机制可能与TLR的信号通路有关〔5，6〕。本实验探讨电针治疗失眠的机制。

1　材料与方法

1.1动物与分组SPF级雄性Wistar大鼠 16只，体质量(200±20)g，由中山大学(大学城)实验动物中心提供，医学动物合格证号：SCXK(粤)2011-0029，NO.44008500008457。将16只大鼠，按随机数字表法分为对照组、模型组、安定组、电针组，每组4只，正常饲养7 d后予以相应处理。实验均在8：00～17：00进行，环境要求安静、通风、室温26℃左右。实验过程中对动物的处理均遵照“关于善待动物的指导性意见”。

1.2主要试剂及仪器戊巴比妥钠购自北京化学试剂公司，批号：69020100；氯苯丙氨酸(PCPA)购自日本TCI公司，批号：H110130000；地西泮(安定)注射液购自天津金耀氨基酸有限公司，批号：1401161；穗鑫牌针灸针购自苏州市华伦医疗用品有限公司，批号：140401； RnaEx与ddH2O购自上海杰瑞生物工程有限公司；Quant cDNA第一链合成试剂盒与 SYBR Green荧光定量 PCR 试剂盒购自天津根生化科技有限公司。KWD-808电针仪为常州市英迪电子医疗器械公司产品。

1.3实验操作PCPA按文献〔7〕，临用前把PCPA粉末用弱碱性生理盐水配置成质量浓度为 20 g/L悬混液。①将模型组、安定组、电针组大鼠按质量分数为45 mg/100 g体质量的标准进行腹腔注射，每日1次，连续2 d。在第1次腹腔注射PCPA 28～30 h后，大鼠出现昼夜节律消失，而对照组正常，表明模型复制成功。②第3～7天模型组大鼠不予任何干涉，正常饲养。③安定组第3～7天进行腹腔注射安定注射液，采用成人催眠剂量(10 mg/d)，根据人鼠给药剂量体表面积折算公式，算得0.92 mg/kg是大鼠的给药剂量，每日1次。④电针组大鼠第3～7天予电针神庭、百会穴治疗，20 min/d，1次/d。百会、神庭穴在大鼠上的具体定位参照《常用实验动物针灸穴位图》，百会：大鼠头部顶骨正中，两耳连线中点；神庭：大鼠额顶骨缝交界线前方处，头部前正中线上。电针操作：用0.25.00 mm×25 mm的无菌针斜刺进针，3～5 mm，随后连接上KWD-808型电针仪，选取连续波型，频率10 Hz，电压6 V。⑤对照组大鼠第1～7天不做任何处理，正常饲养。实验过程中，每天对大鼠进行体重检测。

1.4标本采集、检测方法实验结束后，各组大鼠禁食过夜，用腹腔注射体积分数2%戊巴比妥钠麻醉大鼠。无菌条件下切取其脾脏，冰上分离脂肪等杂质，称体质量，脾脏迅速放入液氮冷冻，再在-80℃冰箱保存，提取RNA，取50～100 mg脾脏组织加入0.3 ml的RnaExTM试剂，使用组织捣碎机破碎细胞5～20 s(2～3次)；再将0.7 ml的RnaExTM试剂加入其中，混匀，室温下静置5 min。加入氯仿0.2 ml，漩涡振荡混匀，于室温下静置2 min。4℃，12 000 r/min离心10 min。放置EP管时，方向必须一致。按1∶1的比例，分别各取400 μl取上清液和异丙醇置于无菌无酶的1.5 ml EP管中，充分混匀，-20℃放置20 min。4℃，12 000 r/min离心10 min，小心弃去上清。将1 ml 75%乙醇加入管中，上下倒置混匀，4℃，12 000 r/min离心5 min，小心弃去上清。再加入1 ml 75%乙醇，上下颠倒混匀，4℃，12 000 r/min离心5 min，小心弃去上清。再次4℃，12 000 r/min离心1 min，用黄枪头吸取残留液体，勿接触沉淀。开盖晾干3 min，让残存的乙醇挥发殆尽，加50 μl DEPC水用手指轻弹管底溶解RNA，室温下放置10 min。使用微量核酸分光光度计测RNA浓度和纯度，较好的R值应在1.8～2.2范围内，取1 μg RNA 进行按25 μl反应体系进行反转录，按照RT试剂盒进行操作。从GenBank里查找基因TLR3、TLR4、MyD88、TAB2及NF-κB序列号，引物由上海锐捷生物工程有限公司设计和合成，内参基因为β-actin。TLR3上游引物：5′-ACCTGATGACCTTCCCTCTA-3′，下游引物：5′-GCAAGTTGGCTGTATCTCGT-3′；TLR4上游引物5′-GGAGGCACATCTTCTGGA-3′，下游引物5′-GGTCATAGTTGTTGCTTCTT-3′；TAB2上游引物5′-TGAAGTGCCTGAAGTTGTT-3′，下游引物5′-TCATGTGATTGCGTAGACC-3′；MyD88上游引物5′-CGACGCCTTCATCTGCTAC-3′，下游引物5′-CCATGCGACGACACCTTT -3′；NF-κB上游引物5′-AAGCACTGTGAGGACGGC-3′，下游引物5′-CGTGAAGTATTCCCAGGTT-3′；内参β-actin上游引物：5′-CCTAGACTTCGAGCAAGAG-3′，下游引物：5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGA-3′。PCR按照试剂盒说明书进行操作，取2 μl cDNA按SYBR Green荧光定量PCR试剂盒在冰上配制PCR反应液，将引物与反转录产物在20 μl反应体系中进行PCR扩增。PCR 扩增条件：起始模板95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火延伸34 s，40个循环。

1.5统计学处理采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2　结　果

实验中，大鼠在经过2 d的PCPA造模后出现昼夜活动不停，易受声音、光刺激而躁动不安，睡眠-觉醒周期紊乱，提示造模成功。经电针和安定干预之后的大鼠则睡眠-觉醒周期得到恢复，白天安静倦卧，逐渐恢复到正常。模型组较对照组大鼠脾脏TLR3、TLR4、MyD88 、TAB2及NF-κB mRNA表达明显增高(P<0.05)，提示大鼠失眠可能与TLR/NF-κB信号通路上调有关。安定组和电针组较模型组TLR3、TLR4、MyD88 、TAB2及NF-κB mRNA表达显著下降(P<0.05)，提示电针可能是通过下调TLR/NF-κB信号通路mRNA表达，抑制IL-2、IL-6、TNF-α等细胞因子的释放，起到改善机体失眠的作用，见表1。

表1　电针对失眠模型大鼠脾脏TLR3、TLR4、MyD88、TAB2、NF-κB mRNA表达的影响

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

3　讨　论

TLRs家族的信号传导高度相似于IL-1R家族，其特点是依赖胞内区的激酶和接头蛋白分子进行信号传导。由于接头蛋白有差异，TLRs在胞内的信号传导途径可有2条：①MyD88 依赖型途径〔8〕。MyD88依赖性信号转导途径较为经典，TLR4是其中典型代表。在此途径中，NF-κB通路最终被其激活从而发挥作用。TLRs与配体结合，由于MyD88羧基末端的Toll/IL受体(TIR)结构域与结合体的二聚化其胞质区的TIR结构域具有同源性，会相互结合，然后活化MyD88，活化后的MyD88通过其氨基末端的死亡结构域(DD)作用于IL-1受体相关激酶(IRAK)氨基端，导致IRAK自身磷酸化。接着与TNF受体相关因子(TRAF)6发生作用，活化TRAF6与转化生长因子β活化激酶1(TAK1)及TAK1的结合蛋白(TAB)形成复合物，NF-κB诱导激酶(NIK)被激活，IκB激酶(IKKs)复合物得到磷酸化，磷酸化IKKs作用于IκB最终IκB磷酸化降解，使IκB/NF-κB复合物中释放出NF-κB，释放出来的NF-κB得到激活，继而移位到细胞核内〔9〕。 NF-κB可结合多种靶基因例如TNF和IL的启动子，启动其转录激活，这些细胞因子作为信号语言，最终激活机体的特异性免疫系统，在调节免疫、细胞增殖、分化及凋亡中发挥作用。②TRIF 依赖型途径〔8〕。TLR3、TLR4均可通过此途径进行信号传导〔10〕。此途径与 MyD88 依赖途径大体类似，差异在于其接头蛋白，此途径的接头蛋白是TIRAP或MAL，TIRAP是一种TIR包含分子，MAL是一种MyD88样分子，最终形成TLR-TIRAP/MAL8-IRAK2 复合体〔11〕。

本实验表明失眠激活了TLR/NF-κB信号通路，引起炎症因子 IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α等分泌的增加，与相关研究〔12，13〕失眠使大鼠血清细胞因子IL-6、IL-2 和TNF-α含量升高是相符的。机体感染时，体内的免疫系统被激活，抵抗病原体的侵入，引起发热和促进睡眠，而睡眠会影响免疫细胞和细胞因子的活性，可见睡眠与免疫功能之间是相互影响的〔14，15〕。有研究发现睡眠不足可抑制刀豆蛋白(Con)A、脂多糖(LPS)诱导的脾细胞增殖反应〔16〕，失眠可引起外周血淋巴细胞对有丝分裂原刺激的增殖反应降低，NK细胞活性降低，多形核粒细胞的吞噬功能降低，机体的免疫功能则下降。在本实验中，失眠激活了大鼠TLR/NF-κB信号传导通路，其TLR3、TLR4、MyD88 、TAB2及NF-κB mRNA表达增强，其TLR3、TLR4、MyD88 、TAB2及NF-κB分子的合成增多，促使各种细胞因子分泌增加，机体的免疫功能开启。TLR/NF-κB信号通路的激活一方面可以诱导强烈的免疫应答，有利于机体抵抗病原微生物的感染；另一方面其过度的激活则过度表达炎性因子，损害机体的健康，引起心肌损伤和自身免疫性疾病〔17〕，还会促进肿瘤特别是炎症相关肿瘤的发生、转移和免疫逃逸〔18〕。本实验失眠大鼠经电针和安定干预后，其上述基因mRNA下降，各细胞因子的过度分泌得到抑制，在改善大鼠睡眠质量的同时，其机体的免疫功能也恢复正常。

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