参松养心胶囊对兔心肌梗死后心肌细胞的保护作用

汪　琳　刘书芳　刘　稳　彭　聪

(漯河市中心医院　漯河医专第一附属医院高血压科,河南　漯河　462000)

心肌梗死是临床上常见的心脏疾病，多数患者常常会伴有心律失常，严重者甚至会出现室颤而导致猝死。参松养心胶囊是由多种中药组成的复方制剂，主要有五味子、麦冬、丹参、黄连等〔1〕。有研究发现，参松养心胶囊能够改善心肌梗死患者的预后，降低病死率和死亡率，可以通过调控各种离子通道蛋白的表达从而保护心肌细胞〔2，3〕，而具体离子通道尚不十分明确。已有研究证实钙离子通道在心肌梗死后的心肌细胞保护中占有重要地位〔4〕；抗心肌梗死药物普萘洛尔可以通过恢复心肌梗死的动作电位时程等途径保护心肌细胞〔5〕，临床上对心肌梗死患者常常采用参松养心胶囊与普萘洛尔的联合用药方案。本研究通过建立心脏梗死的新西兰大耳白兔动物模型，研究参松养心胶囊对钙离子通道蛋白，如缝隙链接蛋白(Cx)43、钠钙交换体(NCX)及兰尼碱受体蛋白(RyR)2表达水平的影响，探究参松养心胶囊对心肌梗死模型心肌细胞的可能作用机制，同时探究普萘洛尔是否具有增强参松养心胶囊保护心肌梗死后心肌细胞的作用。

1　材料与方法

1.1材料新西兰大耳白兔雄性40只，体重2.5～2.8 kg，由郑州大学医学院实验动物中心提供。参松养心胶囊购自北京以岭药业有限公司(批号150302)，普萘洛尔购自阿斯利康制药有限公司(批号160518)；Cx43单克隆抗体(ab11370)，NCX单克隆抗体(ab151608)，RyR2单克隆抗体(ab2868)，GAPDH(ab9485)和辣根酶标记二抗购自美国Abcam公司；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；Trizol Reagent购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒和扩增试剂盒均购自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2动物模型的建立及分组取新西兰大耳白兔40只，采用随机数字表法分为假手术对照组，梗死组，梗死+普萘洛尔组，梗死+参松养心胶囊组，梗死+联合用药组各8只。梗死组以戊巴比妥(30 mg/kg)耳缘静脉麻醉后，经前胸暴露心脏，结扎冠状动脉左前降支。假手术对照组采取假手术，以戊巴比妥(30 mg/kg)耳缘静脉麻醉后，经前胸暴露心脏后在冠状动脉下穿线，但不结扎。以心电监护检测显示Ⅰ,Ⅱ,AVL导联ST段抬高0.2 mV为模型建造成功的标准〔6〕。造模成功后，分别以普食(假手术对照组、梗死组)，普食+普萘洛尔粉(梗死+普萘洛尔组，普萘洛尔剂量0.5 g·kg-1·d-1)，普食+参松养心粉(梗死+参松养心胶囊组，参松养心胶囊原粉0.8 g·kg-1·d-1)，普食+普萘洛尔粉+参松养心粉(梗死+联合用药组，普萘洛尔剂量0.5 g·kg-1·d- 1，参松养心胶囊原粉0.8 g·kg-1·d-1)，喂养8 w后，处死动物，取心梗周围心室组织。

1.3观察指标

1.3.1Western印迹方法取心梗周围心室组织，按照RIPA裂解液说明书提取组织细胞中的总蛋白。BCA法对总蛋白进行定量。取30 μg总蛋白采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分离蛋白，电泳1.5 h后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入Cx43单克隆抗体，稀释比例1∶2 000)，NCX单克隆抗体(稀释比例1∶2 000)，RyR2单克隆抗体(稀释比例1∶2 000)，GAPDH(稀释比例1∶3 000)，4℃过夜，PBS清洗后加入二抗(稀释比例1∶5 000)，37℃孵育2 h，最后电化学发光显影后用凝胶成像分析系统(Bio-Rad，USA)测蛋白条带光密度值。本实验选用GAPDH作为内参对照。分别以Cx43、NCX、RyR2与GAPDH蛋白的光密度值的比值作为Cx43、NCX、RyR2的相对表达量。

1.3.2RT-PCR方法取心肌梗死周围心室组织，采用Trizol试剂一步法提取组织细胞中的总RNA，严格按照逆转录试剂盒和PCR扩增试剂盒说明书操作，将细胞RNA反转录成cDNA,然后扩增成DNA。引物序列见表1，均由上海生物工程技术有限公司合成。RT-PCR反应条件如下： 50℃，2 min；95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，进行35个循环。采用2-ΔΔCt方法表示Cx43、NCX、RyR2 mRNA相对表达量。

表1　RT-PCR引物序列

1.4统计学方法应用SPSS13.0软件行t检验。

2　结　果

2.1RT-PCR结果分析与假手术对照组相比，梗死组Cx43、NCX、RyR2 mRNA相对表达水平显著降低(t=8.485,P=0.000;t=7.483,P=0.000;t=4.234,P=0.001)；梗死+普萘洛尔组Cx43、NCX、RyR2 mRNA相对表达水平与梗死组差异无统计学意义(P>0.05)；与梗死组相比，梗死+参松养心胶囊组Cx43、NCX、RyR2 mRNA相对表达水平均增加(t=3.081,P=0.028;t=3.922,P=0.005;t=8.832,P=0.000)；梗死+联合用药组Cx43、NCX、RyR2 mRNA相对表达水平比梗死+参松养心胶囊组均显著增加(t=2.263,P=0.043;t=2.776,P=0.025;t=2.451,P=0.039)。见表2。

2.2Western印迹结果分析与假手术对照组相比，梗死组Cx43、NCX、RyR2蛋白相对表达水平显著降低(t=9.346,P=0.000;t=6.132,P=0.000;t=13.673,P=0.000)；梗死+普萘洛尔组Cx43、NCX、RyR2蛋白相对表达水平与梗死组差异无统计学意义(P>0.05)；与梗死组相比，梗死+参松养心胶囊组的Cx43、NCX、RyR2蛋白相对表达水平增加(t=3.181,P=0.028;t=3.922,P=0.005;t=6.832,P=0.000)；梗死+联合用药组Cx43、NCX、RyR2蛋白相对表达水平比梗死+参松养心胶囊组均显著增加(t=2.269,P=0.043;t=2.741,P=0.025;t=2.514,P=0.037)。见表3，图1。

表2　各组心梗周围心室组织中Cx43、NCX、RyR2 mRNA相对表达水平

与假手术对照组相比：1)P<0.05；与梗死组相比：2)P<0.05；与梗死+参松养心胶囊组相比：3)P<0.05；下表同

表3　各组心肌梗死周围心室组织中Cx43、NCX、RyR2蛋白相对表达水平

A：假手术对照组；B：梗死组；C：梗死+普萘洛尔组；D：梗死+参松养心胶囊组；E：梗死+联合用药组图1　各组心肌梗死周围心室组织中Cx43、NCX、RyR2蛋白表达

3　讨　论

心肌梗死是冠状动脉堵塞导致的部分心肌缺血性坏死，在我国，心肌梗死的发病率迅速上升，并且发病年龄有年轻化的趋势〔7〕。心肌梗死的发病环节主要有微血管损伤、氧自由基的产生及细胞内钙超载等。目前临床上，有针对心肌梗死各发病环节的治疗药物，然而心肌梗死患者的预后仍不十分乐观，急需寻求更加有效的治疗心肌梗死或降低心肌梗死后心肌细胞损伤的治疗药物或治疗方案。

细胞内钙超载是导致心肌梗死后发生心律失常，最终导致患者不良预后的重要因素之一。钙超载能够通过缩短动作电位时程，诱发短暂后除极，最终导致缺血性心律失常的发生。Zhang等〔8〕研究证实，抑制钙超载可以降低心肌梗死后发生心律失常的发生率。Cx43、NCX、RyR2基因编码相应的钙离子通道蛋白Cx43、NCX、RyR2，参与调节细胞内外的钙离子平衡，心肌细胞内Cx43、NCX、RyR2的表达水平能够反映细胞的钙超载情况。Cx43是心室肌细胞间缝隙连接(GJ)通道的重要成员，同时也是心室肌细胞间电流传导的主要导体〔9〕。Yuan等〔10〕研究证实，Cx43是冠状动脉阻塞后心肌梗死范围大小的最主要的决定因素之一。NCX参与维持细胞内钙离子平衡，在缺血缺氧等病理条件下，NCX引起细胞内钙超载，从而诱发细胞凋亡〔11〕。RyR2是心肌肌浆网中的钙通道，有研究证实，心肌梗死患者的心肌细胞中RyR2表达下降，功能抑制，导致心肌收缩能力下降〔12〕。本研究结果表明普萘洛尔不参与心肌细胞的钙离子通道蛋白的调节，而参松养心胶囊能够通过调节心肌细胞的钙离子通道蛋白从而保护心肌梗死的心肌细胞；采用参松养心胶囊与普萘洛尔联合用药后，普萘洛尔能够增强参松养心胶囊保护心肌梗死后心肌细胞的作用。

综上所述，心肌梗死后的心肌细胞中，钙离子通道蛋白Cx43、NCX、RyR2表达下降，参松养心胶囊部分逆转Cx43、NCX、RyR2表达水平，减轻钙超载对心肌细胞的损害，保护心肌细胞，改善心功能；普萘洛尔能够增强参松养心胶囊对心肌梗死后心肌细胞的保护作用，内在的具体作用机制尚不明确，将在以后的研究中深入探讨。

1向家培,赵劲波,王勇,等.参松养心胶囊对心肌梗死模型小鼠心脏重构的影响〔J〕.医药导报,2016;35(6):588-91,592.

2刘自强,王晞,党松.参松养心胶囊对心梗后心肌的保护作用及机制研究〔J〕.海南医学,2015;26(24):3589-92.

3马柳一,尹玉洁,刘焕,等.参松养心胶囊治疗心律失常药理学机制研究概况〔J〕.中医杂志,2016;57(9):794-7.

4Hassan MQ,Akhtar MS,Akhtar M,etal.Edaravone,a potent free radical scavenger and a calcium channel blocker attenuate isoproterenol induced myocardial infarction by suppressing oxidative stress,apoptotic signaling and ultrastructural damage〔J〕.Ther Adv Cardiovasc Dis,2016;10(4):214-23.

5刘家军,李小燕,杜成芬,等.丹参酮ⅡA磺酸钠对急性心肌梗死大鼠心肌组织间液钙离子与心功能的影响〔J〕.安徽医药,2016;20(4):643-6.

6来欣,王晞,党松,等.胺碘酮联合阿托伐他汀对兔心肌梗死模型心脏MAPD90、VFT的影响〔J〕.山东医药,2015;55(16):24-5.

7Li Y,Wang D,Hu C,etal.Efficacy and safety of adjunctive trimetazidine therapy for acute myocardial infarction:a systematic review and meta-analysis〔J〕.Cardiology,2016;135(3):188-95.

8Zhang XD,Lieu DK,Chiamvimonvat N.Small-conductance Ca2+-activated K+channels and cardiac arrhythmias〔J〕.Heart Rhythm,2015;12(8):1845-51.

9Hawat G,Hélie P,Baroudi G.Single intravenous low-dose injections of connexin 43 mimetic peptides protect ischemic heart in vivo against myocardial infarction〔J〕.J Mol Cell Cardiol,2012;53(4):559-66.

10Yuan MJ,Huang H,Tang YH,etal．Effects of ghrelin on Cx43 regulation and electrical remodeling after myocardial infarction in rats〔J〕.Peptides,2011;32(11):2357-61.

11Almagor L,Giladi M,van Dijk L,etal．Functional asymmetry of bidirectional Ca2+-movements in an archaeal sodium-calcium exchanger(NCX_Mj)〔J〕.Cell Calcium,2014;56(4):276-84.

12Houser SR.Role of RyR2 phosphorylation in heart failure and arrhythmias:protein kinase A-mediated hyperphosphorylation of the ryanodine receptor at serine 2808 does not alter cardiac contractility or cause heart failure and arrhythmias〔J〕.Circ Res,2014;114(8):1320-7.