不同灸量麦粒灸对神经根型颈椎病模型大鼠JAK1、STAT3的影响

粟胜勇　李妮娜　覃忠亮　赵　骏　陈　霞　邱　菊　黄云龙

(广西中医药大学第一附属医院，广西　南宁　530023)

艾灸可使类风湿关节炎(RA)家兔滑膜组织的信号传导及转录激活因子(STAT)3基因表达下降，并通过调控STAT5基因表达，良性调控Janus激酶(JAK)-STAT信号通路。同时，文献报道 STAT3 基因表达下降，可有效缓解关节炎症状〔1〕。麦粒灸是灸法中的一种，治疗神经根型颈椎病(CSR)具有确切的疗效，且目前临床治疗量多选择5壮〔2～4〕，缺乏麦粒灸治疗本病量效关系的相关研究。本研究拟评价JAK-STAT 信号转导通路途径对麦粒灸干预CSR的量效关系。

1　材料与方法

1.1动物及分组由广西医科大学动物实验中心提供的，生产批号为：SCXK桂2014-0002，SPF级Wistar大鼠60只，体重(250±20)g，随机分为正常组、模型组、麦粒灸3壮组、麦粒灸6壮组、麦粒灸9壮组各12只，雌雄各半。动物在实验前适应性驯养1 w。

1.2主要试剂和仪器试剂：苏木素(北京中杉金桥)，盐酸、二甲苯、无水乙醇(天津永大)，磷酸盐缓冲液(PBS，河北博海生物)，氨水(北京中杉金桥)，切片石蜡(北化康泰)，抗原修复液(河北博海生物)，中性树胶(河北博海生物)等。仪器：盖玻片(重庆化玻厂)，超净工作台(苏州，BCM-1000)，洗板机(美国BIO-TEK，型号ELx50)，微量震荡器(无锡县金城仪器厂，型号WZS-Ⅲ型)，显微镜(日本，BX51T-PHD-J11)，倒置照相显微镜(日本，Olympus CK2)，互补金属氧化物半导体(CMOS)(日本奥林巴斯)，多功能真彩色细胞图像分析管理系统(美国Media Cybernetics公司Image-Pro Plus)等。

1.3造模方法参照窦夏睿等〔5〕法进行，大鼠麻醉用10%水合氯醛溶液，按0.35 ml/100 g剂量腹腔注射，待麻醉后俯卧位固定，以手触下颈部附近最高棘突(T2)中心点，将大鼠颈部及上背部毛采用剃须刀剃净，常规消毒后，由此向上于背部正中线做3 cm左右切口，逐层钝性分离皮下组织、颈后部肌群(尽量减少对肌肉组织的大面积破坏)，直至C6～T2左侧椎弓充分暴露，刮净其表面肌肉和韧带等组织，用显微镊轻轻挑开C7和T1，C6和C7椎间隙的黄韧带和结缔组织，用尖嘴蚊式钳轻轻钳开C7左侧椎弓，暴露脊髓，用眼科神经剥离子将脊髓轻推至右侧，再用显微外科镊将大约1.5 cm长，直径0.5 mm的尼龙渔线轻轻沿脊髓纵轴放至C6、C7、T1神经根腋下(渔线经过酒精浸泡，无菌干燥后再浸泡至0.1%的多聚赖氨酸溶液中，以增加其组织黏附性)，插线时注意渔线不要过度下压，以免碰破椎静脉丛导致椎管内大量出血，最后逐层关闭伤口，缝合。模型鼠建立后，大鼠表现动作不活跃。如有外在的惊动时，只能用右上肢及双下肢缓慢爬行，左上肢紧贴胸前，不敢触地，肘关节、腕关节不活动，第2、3趾紧缩。同时，用棉签轻触C7神经根分布区，模型表现为身体迅速躲闪，并持续不断地嘶叫。

1.4麦粒灸治疗麦粒灸3壮组、6壮组、9壮组选用南阳绿莹艾草生物制品有限公司出厂的陈年艾绒，将艾绒搓成直径约0.5 cm，高约0.5 cm的圆锥形艾炷，参照大鼠穴位图谱〔6〕选取大椎穴，并将穴位皮肤毛发用刀片刮净，涂少许万花油，将艾炷置于大鼠穴位皮肤上点燃，灸至大鼠发出连续尖叫声，并出现挣扎等逃避行为时用镊子将艾炷取下，为1壮，1次/d，连续干预7 d。

1.5标本取样与处理动物于造模艾灸干预 7 d后，分别处死大鼠，取出压线段脊柱，掀开背侧椎板(避免压伤脊髓)，选用小于0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm组织块，经过4%多聚甲醛进行固定后剥去脊髓及神经根周围骨质及肌肉成分石蜡包埋，在脊髓发出神经根的部位做5 μm厚连续切片，均采用免疫组织化学SABC染色法分别进行免疫球蛋白(Ig)G染色，进行JAK1、STAT3免疫组化测定。

1.6指标检测方法采用免疫组化方法测定：取脊髓神及经根组织放入4%多聚甲醛溶液中固定，蜡块组织切片厚度约5 μm，防脱切片经过常规脱蜡、脱水；修复抗原，滴加封闭液；根据组化试剂盒步骤进行操作，光镜下观察及多功能真彩色细胞图像分析管理系统观察等。用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照，采用半定量计分方法计算最终显色指数。

1.7统计学方法应用SPSS17.0软件进行t检验、q检验。

2　结　果

模型组JAK1、STAT3表达均显著高于正常组(均P<0.001)。不同灸量麦粒灸组JAK1、STAT3表达均显著低于模型组(P<0.05)；麦粒灸6壮组JAK1、STAT3表达均显著低于麦粒灸3壮组、9壮组(P<0.01)；麦粒灸3壮组与9壮组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　各组压线处脊髓及神经根组织JAK1、STAT3表达比较个/视野)

与模型组比较：1)P<0.05；与麦粒灸6壮组比较：2)P<0.01；与正常组比较：3)P<0.001

3　讨　论

JAK-STAT转导通路系统是众多细胞因子信号转导的共同途径，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡及炎症等过程〔7〕，与CSR疼痛机制密切相关的多种炎性细胞因子，如前列腺素(PG)E2、环氧化酶(COX)-2、白细胞介素(IL)-6、IL-8等的表达均都受到JAK-STAT信号通路的调控。柴立民等〔8〕在胶原诱导性关节炎(CIA)模型大鼠中发现，益气活血解毒方能够抑制IL-6介导的JAK/STAT细胞信号通路活性，从而抑制关节软骨及骨质的炎性损伤。Hui等〔9〕在研究两栖动物脊髓损伤和再生中发现STAT3在急性脊髓损伤后表达增高。Dominguez 等〔10〕研究表明在外周神经损伤后脊髓小胶质细胞中JAK-STAT3通路激活，其激活可能与外周神经损伤后的疼痛相关。以上研究提示JAK-STAT 信号转导通路可能是相关因子信号转导的重要通路。实验发现〔11，12〕艾灸可显著降低实验性RA家兔滑膜液炎症相关细胞因子的含量，降低实验性RA家兔滑膜组织JAK1、JAK2，STAT1、STAT4的基因表达，认为艾灸对动物模型滑膜细胞JAK-STAT 信号通路中相关信号分子表达的有效调控可能是其实现抗炎效应的重要分子机制之一。目前针对不同灸量麦粒灸的研究发现〔13〕，采用艾条、大艾炷、小艾炷治疗3种不同的灸量灸法进行调治原发性痛经，结果证实，3种治疗方法均能有效缓解疼痛，提高疗效；其中艾炷可显著提高患者的皮温耐受性，降低患者穴位皮阻，提高患者对疼痛的耐受性。研究表明〔14〕不同灸量麦粒灸对急性高血脂状态大鼠均具有普遍性调节效应，其中降低甘油三酯方面 6壮和 9壮的效应最佳，升高高密度脂蛋白胆固醇方面 3壮和药物的效应更优。大椎穴为阳脉之海，是六阳经的交会穴，又为督脉之穴，是温阳之重穴，是调节一身阳气的枢纽，对应CSR症状表现部位颈部疼痛、僵硬，上肢的放射痛、麻木等，恰与督脉、足太阳、足少阳及手三阳经循行支配部位吻合，取大椎即能一穴遍通上述诸经，直达病所。本实验研究结果表明，CSR模型大鼠脊髓及神经根组织JAK1、STAT3细胞因子表达增加；不同灸量的麦粒灸可能通过JAK-STAT信号转导通路激活，起到调节CSR脊髓或神经根损伤后JAK1、STAT3细胞因子表达的作用。本实验研究结果发现麦粒灸6壮组在干预CSR时疗效最佳。

1De Hooge AS，van de Loo FA，Koenderes MI，etal.Local activaion of STAT1 and STAT3 in the inflamed synovium during zymosan-induced arthritis：exacerbation of jiont inflammation in STAT1 gene-knockout mice〔J〕.Arthritis Rheum，2004；50(66)：2014-23.

2狄忠，姜硕，林咸明，等.针刺配合麦粒灸治疗颈椎病颈痛近期及远期疗效评价〔J〕.中国针灸，2014；34(4)：325-8.

3陈丽婷.麦粒灸和温和灸治疗神经根型颈椎病的临床疗效对比研究.〔D〕.广州：广州中医药大学，2015.

4尹建平.针刺配合麦粒灸对颈椎病颈痛患者颈部压痛阈的影响〔J〕.临床医学研究与实践，2016；1(9)：55-6.

5窦夏睿，孙建宁，王威，等.中药复方颈舒片对大鼠神经根型颈椎病模型感觉功能的影响〔J〕.中国药学杂志，2007；42(8)：578-81.

6华兴邦，周浩良.大鼠穴位图谱的研制〔J〕.实验动物与动物实验，1991；(1)：1-5.

7薛翔，刘红梅，邵旦兵，等.JAK/STAT 信号通路调节机制的研究进展〔J〕.现代生物医学进展，2015；15(11)：2161-5.

8柴立民，董玢，娄利霞，等.益气活血解毒方对胶原诱导性关节炎大鼠Jak/Stat信号通路相关因子表达的影响〔J〕.中华中医药杂志(原中国医药学报)，2015；30(9)：3364-7.

9Hui SP，Sengupta D，Lee SG，etal.Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish〔J〕.PLoS One，2014；9(1)：e84212.

10Dominguez E，Rivat C，Pommier B，etal.JAK/STAT3 pathway is activated in spinal cord microglia after peripheral nerve injury and contributes to neuropathic pain development in rat〔J〕.J Neurochem，2008；107(1)：50-60.

11刘旭光，房翳恭，余曙光，等.艾灸对实验性RA家兔关节滑膜液FGF、EGF、PDGF含量的影响〔J〕.中医药学刊，2006；24(3)：428-9.

12杨馨，李继书，杨慎峭，等.艾灸对实验性类风湿性关节炎家兔滑膜细胞JAK-STAT信号通路影响的研究〔J〕.针刺研究，2007；32(2)：75-82.

13刘春燕，张晓慧.不同灸量灸法对原发性痛经疗效的影响〔J〕.临床医药实践，2010；19(8B)：1121-2.

14张细柳，王士超，王耀帅，等.不同灸量麦粒灸调节血脂效应的比较研究〔J〕.中医杂志，2011；52 (5)：413-5.