glypican1在识别和鉴定早期胰腺癌中的作用

马洪波　韩　风

(河南省肿瘤医院　郑州大学附属肿瘤医院肝胆胰外科，河南　郑州　450008)

90%的胰腺癌为起源于腺管上皮的导管腺癌，它是最难诊治和预后最差的消化道恶性肿瘤之一，5年生存率小于1%〔1〕。早期胰腺癌临床症状不明显，患者一旦发现身体不适，癌细胞已经扩散至全身多种组织和器官，近年来，胰腺癌的发病率和死亡率明显上升，早期诊断的准确率很低，手术死亡率很高，治愈率很低，胰腺癌越早治疗，效果越好，因此，早期诊断对胰腺癌患者的治疗和预后具有重要意义〔2，3〕。Glypican1在胰腺癌患者体内浓度很高，胰腺癌细胞释放一种微小的环状脂肪外泌体，其内含有DNA、RNA和蛋白质，膜表面和胞质内含有大量的glypican1。glypican1在胰腺癌和乳腺癌中选择性地高表达，具有极高的特异性〔4〕。因此，在临床检测中，将glypican1作为检测早期胰腺癌的标志物具有重要的临床意义〔5〕。本文分析glypican1在早期胰腺癌中的鉴别诊断价值。

1　对象与方法

1.1研究对象2013年1月至2015年1月河南省肿瘤医院肝胆外科因胰腺癌行外科手术的患者50例，其中男30例，女20例，平均年龄(56.5±3.5)岁。因胰腺癌良性病变如慢性胰腺炎、胰腺囊腺瘤和胰腺假性囊肿等行外科手术的患者50例，其中男18例，女32例，平均年龄(60.5±2.5)岁。患者均符合《中华人民共和国卫生行业标准》，患者及其家属均签署书面知情同意书。

1.2检测方法按常规方法收集胰腺良性病变患者和胰腺癌患者的肘静脉血，4℃冰箱储存备用。超速离心收集glypican1+外泌体，用流式细胞仪分离glypican1+外泌体。两组均于术前空腹采集外周血5 ml，离心分离血清，采用电化学发光法检测糖链抗原(CA)19-9水平，阴阳性临界值为39 U/ml。计算CA19-9阳性率。提取病变组织和glypican+外泌体中的DNA，采用突变等位基因特异性扩增法(PCR-MASA)检测K-ras基因点突变。以病变组织诊断结果为金标准，计算glypican1+外泌体检测的敏感性特异性和诊断准确率。

1.3统计学方法采用SPSS19.0软件进行t检验。

2　结　果

2.1glypican1+外泌体检测胰腺癌的效能glypican1+外泌体检测胰腺癌的敏感度、特异性和准确性均显著高于CA19-9和K-ras基因突变检测(P<0.05)。见表1。

表1　glypican1+外泌体检测胰腺癌的效能〔n=50,n(%)〕

与glypican1+外泌体比较：1)P<0.05

2.2良性组和胰腺癌组glypican1+外泌体阳性率比较良性组和胰腺癌组glypican1+外泌体阳性率明显高于CA19-9和K-ras基因突变检测(P<0.05)；与良性组相比，胰腺癌组的glypican1+外泌体阳性率更高(P<0.05)。见表2。

与glypican1+外泌体比较：1)P<0.05；与良性组比较：2)P<0.05

3　讨　论

胰腺癌主要指胰腺外分泌胰腺癌，临床上最常见的是导管腺癌，预后极差，绝大多数患者在确诊时已经不能采用手术治疗。

硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)通过磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上，glypican是HSPG中很特殊的一种类型，目前，哺乳动物中共发现6种glypican，glypican通常作为共受体易化配体和受体的相互作用〔6，7〕。glypican在正常发育和多种癌症的发生发展中起着重要作用，在不同癌症中的表达差异很大，glypican1，3，5都与肿瘤发生发展息息相关，主要影响细胞增殖、分化和凋亡，表达该蛋白的基因突变后，癌细胞的增殖和凋亡均发生很大改变，这是癌症发生转移的重要原因。glypican1在人类神经胶质瘤、胰腺癌和乳腺癌细胞中的表达量增加，glypican5与横纹肌肿瘤的发生发展密切相关，glypican3在肿瘤中的作用待定，有一些研究表明，它可促进肝癌细胞增殖，但其在间皮瘤、卵巢癌和乳腺癌中处于沉默状态〔8～11〕。

胰腺癌是致死率极高的一种癌症。每100例胰腺癌患者中，只有3例可以存活5年以上，而且，近40年来，此癌症的存活率并没有提高。由于胰腺癌是最难早期发现和治疗的癌症之一，确诊时常常已到晚期，只有15%左右的患者适合于接受手术，在早期诊断胰腺癌可以降低胰腺癌的死亡率，因此，胰腺癌的早期诊断一直是研究的重点和难点，寻找准确率高的生物学标志物迫在眉睫〔12～14〕。Glypican在各种癌症中的表达有很大差异，在子宫内膜癌、肺癌、卵巢癌和食管癌中表达量很低，在胰腺癌、乳腺癌、肝癌、大肠癌和黑色素瘤中表达量很高。在不同的癌症中，glypican发挥不同的作用，甚至可能起到完全相反的作用〔10，15，16〕。

胰腺癌外泌体含有glypican1蛋白，可以作为一种潜在的非侵入性的诊断和筛查工具，在临床上用于检测和诊断有可能尚处于适合手术治疗阶段的早期胰腺癌。胰腺癌的早期诊断十分困难，其临床症状与急慢性胰腺炎很相似，有时候很难区分胰腺癌和胰腺炎，因此，胰腺癌的早期诊断成为提高胰腺癌患者生存率和预后的关键。

外泌体是由癌细胞分泌至细胞外的一种直径在50～150 nm的颗粒，由磷脂双分子层包裹着DNA、RNA和蛋白质，可以随着血液系统循环，癌症外泌体不仅仅是一种生物标记物，分析外泌体可以获得许多癌症特异性的遗传突变信息〔17，18〕。早期胰腺癌患者血液中含有富含glypican1的循环外泌体，具有绝对的特异性和敏感性，这些早期胰腺癌患者手术切除癌组织后，glypican1循环外泌体显著下降。检测循环外泌体具有很多优势，只需少量新鲜或冻存的胰腺癌患者血液，可同时分析DNA、RNA和蛋白质等，与循环肿瘤细胞和常用的CA19-9相比，具有更高的特异性和准确性，价格低廉，假阳性低。据报道，在胰腺癌小鼠模型中，磁共振成像(MRI)还未检测到胰腺癌疾病迹象时，glypican1外泌体就可以准确检测到早期胰腺癌〔19，20〕。在早期胰腺癌临床检测中，glypican1循环外泌体的检测可与影像学联合使用，提高检测的灵敏度和准确率。癌症细胞和正常细胞都能分泌外泌体，但是目前并无特异性的标志物来区分这两种外泌体，因此，发现并分离癌症特异性的外泌体且不被正常细胞的外泌体污染，对癌症的诊断和治疗具有重要的临床意义〔20～22〕。CA19-9是最常用的胰腺癌标志物之一，但由于其特异性很低，在临床上的应用受到很多限制。

癌症细胞可以释放数百万携带自身蛋白和遗传物质的外泌体，通过循环系统到达受纳器官，促发炎症和血管形成等过程，让转移至受纳器官的肿瘤细胞更容易增殖并形成新的转移灶，进一步验证了Paget在126年前提出的“种子与土壤理论”学说〔23～25〕。

从早期胰腺癌患者血液中分离出的glypican1循环外泌体中含有K-ras、p53、Tp53、p16、Ink4a/Arf和DPC4/Smad4等基因突变的DNA片段。K-ras家族有3个成员，即H-ras、N-ras和K-ras，K-ras癌基因点突变激活是胰腺癌最早发生的点突变，在胰腺癌组织中最为常见，临床上常用来诊断早期胰腺癌，在患者的胰腺组织、胰液、粪便、胆汁及血浆中均可检测到K-ras突变，但其灵敏度和特异性均不稳定。K-ras常见基因突变位点为第12、12、61位密码子，以第12为密码子的突变最为常见。

本研究结果表明，与CA19-9和K-ras基因突变检测相比，glypican1+外泌体检测具有早期识别胰腺癌更高的临床应用价值。

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