ST195耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌携带blaOXA-23-like转座子的分析

周勇　林云万　张晶　陶霞　侯水平　白志军　吴新伟

鲍曼不动杆菌（Ab）是一种重要的机会致病菌，能引起住院患者呼吸机相关性肺炎、血流感染、腹腔感染以及软组织感染等。尤其是在重症监护病房（ICU），鲍曼不动杆菌常引起暴发流行，带来极高的致病率和致死率。目前，碳青霉烯类抗生素是治疗多重耐药鲍曼不动杆菌的重要药物，然而在全球范围内关于耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的报道正在逐年增加[1-3]。因此本研究拟对ST195耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌携带的blaOXA-23-like转座子进行检测，同时使用PFGE分析ST195菌株同源性以了解和掌握ST195菌株传播的特征。

1　材料和方法

1.1　菌株来源

46株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌由本课题组在2012年5月—2013年11月从广州市两家三甲医院ICU患者中分离得到，分别是31株ST195、11株ST365、3株ST381和1株ST75耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌，所有46株菌经PCR鉴定均携带blaOXA-23-like基因[4]。

1.2　携带blaOXA-23-like转座子的检测

经复苏的菌株接种于血平板，37℃孵育18 h后挑取1环菌苔于50 µl灭菌纯水中充分研磨，菌悬液于100℃水浴10 min后12 000 r/min离心3 min，上清作为PCR检测模板。扩增携带 blaOXA-23-like的 转 座 子 Tn2006、Tn2007、Tn2008和 Tn2009的引物以及扩增体系和条件参考相关文献进行[5-6]。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。阳性产物送广州昊天生物科技有限公司测序，测序结果上传NCBI网站比对分析。

1.3　脉冲场凝胶电泳（PFGE）

使用ApaI限制内切酶进行酶切，沙门菌H9812的基因组DNA经XbaI酶切后作为分子量标准。PFGE图像用BioNumeric 6.6软件进行非加权组平均法（UPGMA）以及通过Dice相似度系数（容忍值设为1.5%）对31株ST195耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌进行聚类分析，1株ST17非耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌作为对照。

2　结果

2.1　blaOXA-23-like转座子的扩增结果

46株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌都检出blaOXA-23-like转座子，其中42株菌检出Tn2006，4株菌携带Tn2009，未检出Tn2007和Tn2008。31株ST195菌株都检出Tn2006，其余11株有Tn2006的是ST365；3株ST381携带Tn2009，剩下1株Tn2009菌株为ST75。

2.2　PFGE分型结果

图1　31株ST195耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌PFGE聚类分析结果，1株ST17敏感菌作为对照，ND：未检出

图1显示来自B医院的9株ST195之间的相似度达到91.6%，而A医院的21株菌以及来自B医院的编号20131430菌株互相之间的相似度高达94.3%，两家医院的ST195菌株PFGE相似度达90.8%，根据文献鲍曼不动杆菌PFGE谱型达到87%相似度的菌株可聚为一簇，表明两家医院的ST195菌株有相同遗传背景。

3　讨论

本课题组之前报道了在广州市两家三甲医院ICU患者血液中分离到46株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌，其中ST195菌株有31株。研究结果推测ST195菌株有可能是本地区的优势菌株[4]。此后，多篇国内发表的论文发现ST195菌株不仅已成为广州市医院的优势菌株，且在国内多个地区的医院内广泛传播[7-8]。有关ST195菌株传播速度加快的原因以及其获得blaOXA-23-like基因的途径尚不明确，特别是目前仍无对ST195菌株blaOXA-23-like基因周围序列的报道。

blaOXA-23-like基因的周围序列共有五种，包括：Tn2006、Tn2007、Tn2008、Tn2008B以及Tn2009。多个研究显示转座子Tn2008和Tn2009是我国多个地区碳青霉烯类耐药分离株携带blaOXA-23-like的重要结构[5-6]。本研究结果显示46株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌中只有4株检出Tn2009，其余42株全部携带Tn2006，主要是31株ST195。本研究利用PFGE对31株ST195菌进行了分析，结果显示来自两家医院的31株菌可归为一个聚类（相似度90.8%），这个结果说明这两家医院分离的ST195菌株很可能来自同一克隆。

综上所述，研究结果表明ST195耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌能在不同医院间克隆传播，而且之前研究结果发现此型菌株耐药性很强，提示我们应加强ST195菌株的监测特别是院内环境中的监测，采取必要措施防止ST195菌株在院内和院间的传播。

[1]Nowak P，Paluchowska P． Acinetobacter baumannii：biology and drug resistance-role of carbapenemases[J]． Folia histochemica et cytobiologica，2016，54（2）：61-74．

[2]顾心雨，张佳佳，胡春玲，等． 280株细菌培养阳性病原菌分布与耐药性分析[J]． 中国实用医刊，2016，43（24）：106-109．

[3]刘艳洁，张灵利． 2016年细菌培养及耐药性分析[J]． 中国现代药物应用，2018，12（2）：196-197．

[4]Zhou Y，Wu X，Zhang X，et al． Genetic Characterization of ST195 and ST365 Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii Harboring blaOXA-23 in Guangzhou, China．[J]． Microbial Drug Resistance，2015，21（4）：386-390．

[5]Chen Y，Gao J，Zhang H，et al． Spread of the blaOXA-23-Containing Tn2008 in Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii Isolates Grouped in CC92 from China[J]． Frontiers in microbiology，2017，8：163．

[6]Liu LL，Ji SJ，Ruan Z，et al． Dissemination of blaOXA-23 in Acinetobacter spp． in China： main roles of conjugative plasmid pAZJ221 and transposon Tn2009[J]． Antimicrobial agents and chemotherapy，2015，59（4）：1998-2005．

[7]Tan Y，Zhou K，Tang X，et al． Bacteremic and non-bacteremic pneumonia caused by Acinetobacter baumannii in ICUs of South China： A Clinical and Microbiological Study[J]． Scientific reports，2017，7（1）：15279．

[8]Hua X，Zhou Z，Yang Q． Evolution ofAcinetobacter baumannii In Vivo： International Clone II，More Resistance to Ceftazidime，Mutation inptk[J]． Frontiers in Microbiology，2017，8．