宝山堇菜Pb耐性相关基因筛选及表达特性*

邓冬梅，艾红霞，邓金川，廖斌

(1. 广西科技大学生物与化学工程学院∥广西糖资源绿色加工重点实验室，广西 柳州 545006；2. 中山大学生态进化学院∥生物防治国家重点实验室∥广东植物资源重点实验室，广东 广州510275)

超富集植物(hyperaccumulator)是指能够超量吸收重金属(或非金属)并将其转运到地上部分贮藏起来的植物，在重金属污染土壤的植物修复中有重要应用潜力[1]。深刻探讨超富集植物对重金属的耐性和富集基因，对进一步利用基因技术提高重金属污染土壤植物修复效率有重要意义[2]。相对于其他重金属，在分子水平上对Pb超富集机理的探索很少[3]。

宝山堇菜Violabaoshanensis是我国发现的一种Cd超富集植物[4 - 5]，也具有较强的Pb耐性和富集能力[6]，因此，宝山堇菜为重金属富集、耐性相关基因的研究提供了丰富的基因资源。但目前，基本没有在分子水平上对宝山堇菜的Pb超富集机理的探索。

就发现与某一性状相关基因的方法来讲，抑制差减杂交(SSH)被认为是一种较为适合的技术，可在转录水平上发现两材料间差异表达的基因[7]。据此，本研究利用SSH技术筛选宝山堇菜根在Pb胁迫下特异表达的EST(Expressed Sequence Tags)基因克隆片段，并选择部分克隆片段分别进行半定量RT-PCR和Northern杂交分析验证其表达特征，为从分子水平揭示宝山堇菜对Pb的耐性和富集机理提供参考。

1　材料与方法

1.1　植物材料

以组织培养获得的无菌宝山堇菜为材料，选取大小一致，根系发达的无菌苗，流水洗去根表面琼脂，于1/2 Hogland营养液中培养2周后用于后续实验。

1.2　宝山堇菜SSH文库构建

1.2.1 RNA提取和cDNA合成对预培养2周的宝山堇菜进行300 μmol/L Pb(NO3)2处理，并设立不加Pb的对照处理。处理2 d后，用Trizol方法提取两个处理宝山堇菜根中的RNA，并利用OligotexTM mRNA纯化试剂盒(QiaGen公司)分离RNA中的mRNA，利用Super SMARTTM cDNA反转录试剂盒(Clontech公司)合成cDNA，并利用QIAquick PCR Purification Kit(QiaGen公司)纯化合成的cDNA。

1.2.2SSH差减杂交以Pb处理的cDNA为tester，以不加Pb对照处理为driver，利用PCR-Select cDNA Subtraction Kits(Clontech公司)构建SSH文库。首先对tester和driver进行RsaI酶切，等分成两份，分别连接上不同接头，而Driver cDNA不连接头。连有不同接头的Tester cDNA分别与过量的Driver cDNA混合，进行两次差减杂交。

1.2.3差异cDNA文库建立及序列分析以杂交产物为模板，以接头1和2R设计的巢式引物为引物，进行两次抑制PCR。将2种杂交的PCR产物分别克隆至pGEM-T vector(Promaga公司)中，建立差异cDNA文库。将有效克隆的菌液送去上海英竣公司测序，得到每个克隆的EST序列，所有的ESTs在NCBI的网站上(http∥www.ncbi.nlm.nih.gov)进行比对。

1.3　宝山堇菜Pb特异表达基因检测

1.3.1植物处理及RNA提取对预培的宝山堇菜无菌苗分别进行不同浓度(0、60、300、600 μmol/LPb (NO3)2，处理2 d)和时间(0、1、2、7 d，处理浓度300 μmol/L Pb (NO3)2)的Pb处理，及不同胁迫处理(300 μmol/LCdSO4，100 mmol/L NaCl和φ=37%的H2O2，处理1 d)。处理结束后，利用2.2中方法提取各处理宝山堇菜根和叶片中RNA。

表1　PS10、PS13号EST克隆片段及18S rRNA RT-PCR特异引物Table 1　Primer sequences of RT-PCR of PS10, PS13 gene clone, and 18S rRNA

1.3.2半定量PCR利用OmniscriptTMReverse Transcriptase(QiaGen公司)合成cDNA第一链。以宝山堇菜体内18S rRNA扩增片断为内参。为研究PS10和PS13号EST克隆片段在宝山堇菜中的表达特性，利用Primer Premier 5设计18S rRNA及PS10和PS13号EST克隆片段上下游扩增特异引物(表1)，并利用设计引物进行半定量PCR。

反应体系(25 μL)包括: ExTaq酶mix 19 μL，cDNA第一链模板2.0 μL，上下游引物各2 μL。PCR温度程序为：94 ℃预变性1 min，94 ℃变性0.5 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸2 min，循环28次，最后72 ℃终延伸7 min，4 ℃保存。PCR样品进行w=2%琼脂糖胶电泳，目的条带与18S rRNA条带的强度比代表了目的基因的相对表达水平。

1.4　Northern 印迹转移

对2.1中提取的各处理的RNA进行w=1.2%琼脂糖电泳，电泳完毕后，将RNA从凝胶转移到带正电的尼龙膜上，并通过紫外交联固定于膜上。

提取需要检测的克隆片段的质粒DNA，然后采用SSH技术中的第一次PCR的程序进行扩增，PCR产物纯化后作为探针模板。同时利用Oligo-labelling Kit(TaKaRa公司)进行【α-32P】dCTP探针制备。将转接有RNA的尼龙膜在42 ℃预杂交4 h后，加入5 μL已标记好的探针，42 ℃下进一步杂交16 h，然后洗去未杂交探针，压入磷屏进行放射自显影，在台风(Typhoon)仪器上读取磷屏数据。

2　结果与讨论

2.1　RNA、cDNA及文库质量检测

对照与Pb处理下宝山堇菜根中的RNA电泳可看到28S rRNA 和18S rRNA的清晰条带，无托尾现象，并且28S rRNA条带近乎是18S rRNA条带宽度的2倍，另外看不到基因组DNA以及蛋白污染(图1)，说明提取的RNA质量较好，无降解。

图1　宝山堇菜对照和300 μmol/L Pb处理根中总RNA1.CK；2.300 μmol/L Pb2+Fig.1　Total RNA of control and 300 μmol/L Pb in V. baoshanensis root 1. CK; 2. 300 μmol/L Pb2+

图2　宝山堇菜cDNA合成及RsaⅠ酶切产物的电泳检测Fig.2　Double strand cDNA syntheses of V. baoshanensis and its Rsa Ⅰ digestion 1和2分别为对照和Pb处理的双链cDNA；3和4分别为对照和Pb处理的酶切产物

图3　SSH文库部分克隆质粒的PCR产物Fig.3　PCR detection of partial clone plamid of SSH library 1-11： the PCR product of clone plasmid

宝山堇菜对照和Pb处理的双链cDNA分布在0.2～2 kb之间，在0.5～1 kb之间的丰度较高，说明双链cDNA的完整性有保证，能充分代表mRNA在片段分布及丰度上的特点。而RsaI酶切产物的分布范围为0.1～1 kb，最高丰度在500 bp左右，分布范围明显缩小，说明酶切效果明显(图2)。PCR检测结果显示，文库中绝大部分克隆含有插入片段，片段大小介于150～1 000 bp之间，平均的插入片段大小约500 bp左右(图3)。

2.2　EST测序分析

检索结果显示随机测序的140个克隆代表40个独立片段，片段大小在120～890 bp之间，有27个独立片段与已知基因有同源性(表2)，它们在细胞生命活动过程中有着很广泛的作用，根据其功能分为5类：① 抗氧化酶类；② 胁迫蛋白类；③ 信号转导类；④ 代谢相关；⑤ 其它功能待确定cDNA(表2)。这些与EST克隆片段同源性较高的基因很多也为重金属胁迫、解毒相关基因，如IIB型Ca-ATP酶(type IIB calcium ATPase)[8 - 9]，泛素延长蛋白(ubiquitin extension protein)[10 - 11]，金属硫蛋白基因(putative metallothionein-like protein (Mt2) mRNA)[12 - 13]等，另外还有一些与其他胁迫相关的基因，如：琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase)[14 - 15]，磷酸甘油酸变位酶(phosphoglyceromutase)[16 - 17]。说明宝山堇菜对Pb胁迫的响应也有很多胁迫相关基因表达，且不是一个简单的调控过程，而是一个整体层面的反应。

表2　利用SSH技术筛选出的差异表达克隆在GeneBank中的核酸同源性比较结果Table 2　Blastn results of the different expressed clones via SSH comparing with the genes in GeneBank

图4　PS10号和PS13号克隆的RT-PCR半定量分析Fig.4　RT-PCR analysis of the expression of the PS10 and PS13 clone

2.3　半定量RT-PCR和Northern杂交分析

文库中和Sesamumindicum木质素转糖基酶(xyloglucan endotransglycosylase, XTH)基因同源的PS10号EST克隆片段在Pb胁迫下宝山堇菜根和叶中均属上调表达，其表达量随胁迫浓度增加先升高，在300 μmol/L Pb最高，胁迫浓度继续升高时表达量略有下降，此外该克隆片段表达量随胁迫时间的延长逐渐上升，但对其他胁迫响应不太明显(图4，图5)。木质素转糖基酶催化木质素的水解，受赤霉素GA3等植物激素调节，在细胞壁延伸和重建过程中起作用[18]。在菟丝子侵染、干旱、低温和高盐胁迫和蚜虫噬咬下，该基因都有表达[19 - 20]。Krzesowska等[21]研究表明细胞壁的增厚是很多植物对Pb胁迫的主要响应方式。拟南芥属、杂交白杨和浮萍等不同植物在收到Pb胁迫后都出现细胞壁的增厚，以将更多的Pb固定在细胞壁上。宝山堇菜中，木质素转糖基酶的上调表达是否和此过程相关需要进一步实验来解释。但木质素转糖基酶基因对其他胁迫没有明显响应说明不同植物对胁迫的响应机制是不相同的。

图5　PS10号克隆的Northern分析Fig.5　Northern hybridization of the PS10 clone

文库中PS13号克隆片段和GTP结合蛋白(GTP binding mRNA)同源性很高。GTP结合蛋白可能在Ca离子，茉莉酸(JAs)和水杨酸(SA)等介导的信号传导途径中起到重要的作用，为细菌侵染和高温等胁迫下的响应基因[22 - 23]。JAs和SA介导的信号传递途径与植物抗性密切相关，且JAs的积累也和重金属Cu和Cd的抗性有关[24]。但GTP结合蛋白和Pb胁迫间的直接相关关系目前还没有报道。PS13号EST克隆片段随Pb胁迫浓度的增加，表达量逐渐增加，在600 μmol/L Pb时达到最大。在叶中，该片段表达量的变化和Pb胁迫浓度增加无明显关系。300 μmol/L Pb胁迫下，随处理时间的延长，宝山堇菜根和叶中该片段的表达量也逐步上升，处理时间为7 d时表达量最大。对其他胁迫，该片段在宝山堇菜根和叶中的变化基本不明显，Na胁迫下，在宝山堇菜叶中表达量略有增加(图4、图6)。这说明，宝山堇菜根中，Pb胁迫下，GTP结合蛋白基因可能是上调表达基因，GTP结合蛋白可能参与Pb胁迫信号的传导，其作用方式需进一步研究。

图6　PS13号克隆的Northern分析Fig.6　Northern hybridization of the PS13 colone

3　结　论

1)利用SSH技术筛选得到27个在Pb胁迫下特异表达的EST基因克隆片段，这些基因在植物体内执行多种功能，说明宝山堇菜对Pb胁迫的响应是一个整体层面的灵敏反应。

2)半定量RT-PCR和Northern杂交分析表明，与GTP结合蛋白、木葡聚糖内源转糖基酶基因相似性高的2个克隆片段在宝山堇菜根中为Pb胁迫上调表达基因。Pb胁迫下，木葡聚糖内源转糖基酶可能参与宝山堇菜在Pb胁迫下的生理调节反应，而GTP结合蛋白可能直接参与宝山堇菜体内Pb胁迫信号的传导。

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